miRNA调控鹿茸生长发育的研究进展

韩若冰 韩 磊 汤吉伟 赵德睿 李和平

(东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040)

鹿茸是雄性鹿科(Cervidae)动物(除驯鹿Rangifertarandus外)特有的能周期性再生的附属器官[1]，其在快速生长期的细胞分裂速度是癌细胞的30多倍[2]。现已有研究表明梅花鹿(Cervusnippon)鹿茸生长速度可达到12.5 mm/d[3]，马鹿(Cervuselaphus)甚至可达到27.5 mm/d[4]。由于其具有生长速度甚至比癌细胞快却不发生癌变的特点，鹿茸一直以来都是广大科学家研究的重点和热点。鹿茸的生长发育与再生受到遗传因素、营养因素、光照、温度、睾酮等体内激素的影响。决定鹿茸发生及再生的关键组织为鹿茸干细胞，与此同时，在鹿茸发生及鹿茸每年的再生过程中，均需要干细胞微环境的参与[5]。然而，利用传统的实验技术很难从分子水平上深入探究鹿茸生长发育的机理。随着高通量测序技术的兴起和发展，越来越多的科学家试图运用miRNA在基因表达调控中发挥的作用来探究鹿茸独特的生物学特性(快速生长发育和周期性再生)，以期为人类癌症治疗甚至是器官再生研究提供新的思路和见解。

microRNA(miRNA)是一类由植物、动物和一些病毒编码的小分子单链非编码RNA(-22个核苷酸)[6-9]。首次在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中被发现，作为一种转录后调控因子，通过与靶mRNA的3′UTR完全或不完全互补配对在基因表达调控中发挥着重要的作用[10]，已在多种动植物体中广泛应用[11-13]。在鹿茸生物学领域也有研究表明miRNA可以通过直接或间接的作用调控鹿茸的生长发育。本文结合已有文献对现有microRNA调控鹿茸生长发育的研究进行了总结并且提出展望。

1 miRNA相关技术的研究概况

1.1 miRNA芯片技术的应用

对于鹿茸生长发育的研究主要有直接克隆和RT-PCR法。2004年，利用人类及鼠的特异性寡核苷酸探针的微芯片筛选miRNA的实验证明miRNA芯片技术具有特异性强、灵敏度高和稳定性好等特点[14]。miRNA芯片技术可以用来鉴定动植物体中miRNA的存在及表达量情况，是检测不同组织或部位间miRNA表达的重要方法[14]，运用miRNA芯片技术来了解miRNA在鹿茸生长发育中的调控作用是一种经济而有效的方法。但现阶段关于miRNA在鹿茸生物学领域(生长发育以及周期性再生)的研究报道较少。

1.2 RNA-seq测序技术的应用

随着分子生物学的发展，高通量测序技术应运而生。RNA-seq是新一代高通量测序技术，运用这种高通量测序技术可以将组织中的RNA(mRNA，miRNA，lncRNA)全部或部分测出来，反映它们在不同组织或者细胞之间的表达水平，并且可以鉴定出组织或者细胞之间差异性表达的RNA(mRNA，miRNA，lncRNA)。其中，Small RNA-seq技术是一种运用高通量测序技术鉴定动植物体中miRNA表达量情况的方法。其主要通过测序原始数据质控、标准数据分析、miRNA家族分析、miRNA靶基因预测和靶基因GO、KEGG富集分析等对组织内所有miRNA进行测序和表达定量。从而进一步探究其在动植物体中发挥的调控作用。随着small RNA-seq测序技术的日益发展，miRNA在鹿茸生长发育中的研究也取得了一定的突破和进展。

2 miRNA在鹿茸中的研究进展

2.1 鹿茸组织中miRNA的鉴定

利用miRNA芯片技术对鹿茸组织中miRNA进行鉴定的相关报道较少。目前主要有对于马鹿和梅花鹿miRNA的相关研究，对于其他的鹿科动物还少有涉及。崔东明等[15]对鹿茸间充质细胞和软骨细胞进行了miRNA鉴定并进行了差异表达分析。通过培养鹿茸间充质细胞及软骨细胞、制备鹿茸顶端间充质及软骨组织miRNA芯片、芯片杂交及数据分析，最终得到鹿茸间充质部位的miRNA 289条(117个miRNA表达上调，71个miRNA表达下调)，软骨部位存在的miRNA 304条(97个miRNA表达上调，87个miRNA表达下调)。其中，软骨组织和间充质组织中差异表达的miRNA有158条。通过miRNA芯片技术鉴定鹿茸顶端组织中的miRNA为将来miRNA在鹿茸生长发育中的研究提供了重要的数据参考基础。

Chen等[16]鉴定了马鹿软骨组织中保守的miRNA和新的miRNA。最终在马鹿软骨组织中鉴定出399个miRNA，其中345个为高度保守的miRNA，54个为鹿茸软骨组织特有的miRNA，为马鹿鹿茸的生物学研究以及再生鹿茸软骨组织中miRNA的研究提供了参考。Ba等[17]通过高通量测序技术对梅花鹿增茸期和休眠期的骨膜干细胞进行miRNA测序，鉴定得到2个时期的差异表达miRNA，其中8个miRNA表达显著下调，6个miRNA表达显著上调。鉴定出20种保守的鹿茸特有的miRNA。通过对靶基因进行GO和KEGG富集分析，结果表明Wnt、MAPK和TGF-beta信号通路可能是鹿茸再生过程中必不可少的信号通路，但是这些信号通路在鹿茸再生的过程中如何发挥调控作用需要进一步的实验来证明。

2.2 miRNA对生长因子的调控作用

多种生长因子及其受体在鹿茸的生长发育过程中均发挥着重要的调控作用。如：表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等。随着后续研究的深入，对于这几种生长因子在鹿茸生长发育过程中的功能以及在鹿茸顶端组织中的表达量情况已有相关研究。目前miRNA对VEGF、TGF、IGF发挥的调控作用以及对鹿茸细胞增殖产生的影响也开展了相关研究。

血管内皮生长因子(VEGF)主要存在于鹿茸顶端组织的前成软骨层及软骨层，并且对于鹿茸软骨内血管的形成具有一定的作用[18]。李璐[19]通过实验证实VEGF是miRNA-93-5P与miRNA-20b-5p调控的靶基因，转染实验证明miRNA-93-5P与miRNA-20b-5p的过表达能抑制鹿茸软骨细胞的正常生长发育。还证明了梅花鹿软骨细胞中VEGF的表达与bFGF、IGF的表达存在一定的关联性。这些生长因子之间可能存在着某种相互作用，从而共同调节着梅花鹿鹿茸的生长发育。然而生长因子如何通过相互作用来调节鹿茸生长发育还尚未被揭示。另有研究表明miRNA-15a和miRNA-15b是鹿茸VEGFR的新调控因子[20]，它们抑制鹿茸软骨细胞的增殖。TGF-B是一类多功能的生长因子，在调节细胞生长、分化等方面具有一定的作用[21]。鹿茸顶端组织的5个层中均具有TGF-B1的表达，但其表达量不尽相同。TGF-B可与Wnt信号通路共同作用使细胞维持在间充质细胞的状态。韩香玉[21]通过Hiseq深度测序、qPCR和双荧光素酶活性检测证实了miRNA-148a-3p靶向调控TGF-B2基因，同时，利用MTT法表明miRNA-148a-3p对鹿茸软骨细胞体外增殖活性有一定的抑制作用。转染miRNA-148a-3p后TGF-B2、TGF-βRⅡ和IGF-1蛋白的表达水平有所下降，证明这三者之间存在一定的关联性。这也印证了李璐[19]的实验，说明不同的生长因子之间可能存在着某种联系，它们共同作用调节鹿茸的生长发育。

2.3 miRNA对鹿茸细胞增殖的作用

随着高通量测序技术的迅速发展，应用small RNA-seq技术对鹿茸生长发育进行的研究越来越多。Yao等[22]分析了鹿茸生长发育过程中miRNA的表达量，其中12个基因在鹿茸的快速生长期表达量显著升高(Fn1，Sox9，Col2a1，Acan，Col9a1，Col11a1，Hapln1，Wwp2，Fgfr3，Comp，Sp7 和 Ihh)，该研究还发现了一些miRNA和基因共同作用参与了软骨形成和软骨内成骨的过程。比如：miR-3072-5p，miR-1600，miR-34-5p，miR-6889-5p和 miR-6729-5p。最终通过比较鹿茸生长中心的快速生长期和初期生长期，构建了miRNA-mRNA调控网络。对于将来鹿茸发育过程中miRNA和靶基因、不同miRNA之间以及不同基因之间的研究具有重要的意义。Hu等[23]通过对鹿茸重量存在差异的100个个体的鹿茸尖部增殖区进行高通量测序，共鉴定出1 082个miRNA，鉴定得到一些基因(COL1A1，COL1A2，COL3A1，FN1和ATP6)和一些miRNA(miR-21，let-7i和 miR-27b)与鹿茸的生理生长特性高度相关。该研究最终筛选得到可以作为鹿茸重量DNA标记的14个候选基因和6个候选miRNA，并且构建了关于鹿茸生长发育的miRNA-mRNA调控网络，该研究对从分子水平上揭示鹿茸重量的不同具有一定的参考基础。孟星宇[24]在制备鹿茸软骨细胞和间充质细胞的miRNA芯片基础上，运用实验证明miR-1对鹿茸软骨细胞增殖有明显的抑制作用，S期细胞含量明显减少，G0/G1期细胞含量明显增加。李婷等[25]通过双荧光素酶报告基因检测实验确定了let-7a、let-7f是IGF-1R基因的靶基因，并且证实let-7a、let-7f对鹿茸顶端组织的软骨细胞增殖具有抑制作用，而let-7a、let-7f的抑制物可以通过上调细胞内IGF-1R的表达量进而使细胞增殖速度加快。Hu等[26]验证确定了miR-18a是鹿茸增殖的重要调控因子，且可以显著抑制鹿茸软骨细胞的增殖。对于miRNA对鹿茸细胞增殖影响的研究，填补了RNA组学在鹿茸生物学中运用的数据，为鹿茸生长发育的进一步揭示提供了参考。

2.4 miRNA对鹿茸再生调控的研究进展

鹿茸的周期性再生是一个复杂的过程，伴随着皮肤、血管、神经和骨组织等组织的再生。目前对于miRNA在鹿茸再生的过程中发挥怎样的作用还未见详细的报道。Runx2在软骨细胞分化和成熟过程中起重要作用，Runx2可能在梅花鹿鹿茸再生的过程中扮演着重要的角色[27]，而miRNA-27a可以通过下调Runx2的激活剂进而抑制Runx2的表达[28]。由此可见miRNA-27a是鹿茸再生过程中一个重要的miRNA，可能通过调控鹿茸软骨组织的再生进而调控鹿茸的整个再生过程。鹿茸的再生属于割处再生，茸角伤口愈合而不留瘢痕。在大鼠伤口中局部使用miRNA-29b治疗可以减少伤口愈合过程中瘢痕的形成，这提示我们miRNA-29b可能在鹿茸割处再生的过程中也发挥着不可或缺的作用[29]。但是对于miRNA在鹿茸再生中发挥的具体作用还需要进一步的实验来阐明。

3 总结与展望

鹿茸生长发育以及周期性再生的相关研究一直以来都是众多学者研究的重点和热点。鹿茸再生由内部组织(软骨和骨)和外部组织(皮肤、血管和神经)所构成，鹿茸的生长发育是一个复杂的过程，在这个过程中，鹿茸的骨组织、皮肤、血管、神经等组织均在生长。众多细胞因子之间通过相互作用协同调节鹿茸生长发育。探究miRNA对于鹿茸生长发育的作用有助于我们从RNA组学的角度了解鹿茸的生长发育，这无疑加速了人们对鹿茸生长发育独特生理学特点的认知。

综上所述，目前对于miRNA通过介导生长因子进而调控鹿茸生长发育的研究主要集中在对VEGF、IGF和TGF这3个生长因子的研究上，对于miRNA如何靶向其他的生长因子以及对鹿茸的生长发育发挥怎样的作用和影响等方面尚未见报道。Yao[22]等构建的鹿茸生长中心的miRNA-mRNA调控网络是一个复杂的调控网络，对于其中不同基因之间、不同miRNA之间、miRNA与它的靶基因之间通过什么样的竞争和协作关系来调控鹿茸生长发育我们尚未了解。对于这个庞大而又复杂的调控网络也知之甚少。同时，由于现有鹿科动物的基因组比较匮乏，使得鹿科动物的研究具有一定的局限性。在接下来的研究中，应结合RNA组学不断探索miRNA的调控机制以及对鹿茸生长发育甚至是再生的作用，这将为鹿茸生长发育甚至是人类肿瘤治疗以及器官再生提供重要的参考依据。