白色念珠菌与表皮葡萄球菌混合生物膜研究进展*

2019-02-17杨继琛黄云超综述叶联华审校

重庆医学 2019年15期

杨继琛，黄云超综述，叶联华审校

(昆明医科大学第三附属医院/云南省肿瘤医院胸外科一病区，昆明 650118)

医用生物材料已在临床上广泛应用，但生物材料植入引起的感染成了困扰临床工作的难题。表皮葡萄球菌是院内感染常见的条件致病菌，其黏附在生物材料表面形成生物膜，引起植入物相关感染。细菌生物膜(bacterial biofilm，BF)是细菌附着于惰性或活性实体表面，并由自身分泌的细胞外基质包裹形成的结构性细菌群落[1]。生物膜内的细菌耐药性极强，在感染部位难以彻底清除，临床上约65%的感染与微生物在组织、器官或医疗设备表面形成生物膜有关[2]。患者在治疗过程中及免疫力低下时常并发白色念珠菌混合感染，形成细菌-真菌混合生物膜，耐药性更强，治疗难度更大。其病死率为单一病原微生物感染的2倍，临床治愈非常困难[3]，因此，对细菌-真菌混合生物膜感染的控制成为临床亟待解决的问题。本文对白色念珠菌-表皮葡萄球菌细菌混合生物膜的形成相关因素、结构、特征、耐药机制等进行综述，总结其相关研究进展。

1 白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜的形成与结构

有关白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜的形成与结构的报道大多通过体外实验获得，陈颖等[4]通过在聚氯乙烯(PVC)材料表面建立白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜体外模型来观察混合生物膜的形成与微观结构。将表皮葡萄球菌与白色念珠菌混悬液在PVC材料表面进行共培养，在培养2、6、12、24、48、72 h时用激光共聚焦显微镜及扫描电镜观察各时间点混合生物膜结构。研究表明，混合生物膜的形成主要分为初始黏附和细菌分泌外黏质聚集两个阶段。在共培养早期(2～6 h)，表皮葡萄球菌黏附于真菌细胞上，二者通过菌体表面多糖黏附素、甘露糖蛋白、疏水性蛋白等与PVC材料表面发生界面效应并在表面黏附。之后病原菌相互聚集形成菌落，病原菌厚度增加并分泌大量黏液包裹菌体，48 h时厚度达峰值，形成成熟生物膜。

48～72 h时，由于生物膜内微生物代谢及营养物质逐渐消耗，生物膜主体收缩并趋于稳定。生物膜外层与主体连接不紧密并易脱落，脱落后可发生再次黏附，进入生物膜生长的下一周期循环。扫描电镜观察到生物膜主体中部分菌体固缩、崩解，呈现以单个或数个菌丝态酵母菌黏附多个表皮葡萄球菌的珠串形态；三维重建显示混合生物膜表面有较多活菌构成的凸起，随着培养时间延长，PVC膜表面孢子状白色念珠菌逐渐伸长，变化为假丝状及菌丝状。成熟期白色念珠菌生物膜为具有有机三维结构的致密网状系统，在细胞外基质包裹下由孢子、菌丝体和假菌丝组成。表皮葡萄球菌附着于白色念珠菌菌丝四周，构成复杂多层次网状混合生物膜。

2 混合生物膜形成的影响因素

2.1菌体蛋白对生物膜的影响白色念珠菌细胞壁特别是细胞壁蛋白对于真菌的生长、毒性、致病性，尤其是细胞壁在提供对宿主组织的黏附和抵抗宿主的防御功能上非常重要。白色念珠菌凝集素样序列(agglutinin like sequence,ALS)基因家族成员中的ALS3是白色念珠菌菌丝特有基因，其编码的细胞壁糖蛋白Als3P诱导酵母菌对宿主的黏附，而且Als3与菌丝细胞壁蛋白1(hyphal wall protein 1，Hwp1)、聚苯乙烯黏附增强蛋白1(Eap1)构建一个具有互补黏附功能的网络，以便有效对宿主进行定植、黏附，在混合生物膜形成过程中，通过绑定葡萄球菌到ALS3P的N-末端片段区域和异体表达ALS3p的酵母菌重组体上而使葡萄球菌黏附到白色念珠菌的菌丝上，而且白色念珠菌具有高度保守的淀粉样蛋白形成序列，能使白色念珠菌互相聚集。ALS3p在促进白色念珠菌菌丝的内吞作用方面起着重要作用,ALS3基因缺失的真菌株不能形成结构完整的生物膜[5-6]。

白色念珠菌的Hwp1由HWP1基因编码，其促进细胞壁的形成、菌丝发育和对宿主细胞的黏附，对于细胞内信号传导有重要作用。Hwp1能促进白色念珠菌与宿主上皮细胞在黏附早期的结合，HWP1基因缺失株在体内外均不能形成完整生物膜[7]。在高等真核生物中，酪蛋白激酶1 (CK1)家族是Wnt信号通路的一部分，并调控细胞分化、跨膜运输、DNA损伤反应等，近年来发现，酵母酪蛋白激酶2(CaYck2p)是CK1家族的主要真菌同源物，在大多数真核生物中存在高度保存的丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员。作为一种多功能激酶，它控制着酵母菌形态发生、生物膜形成、细胞壁的完整性和与宿主细胞的相互作用[8]，尤其是CaYck2p可能在调控菌丝特异性基因的遗传抑制和调节细胞壁的代偿性形成方面发挥重要作用。研究发现，当白色念珠菌在酵母诱导条件下生长尤其是在酵母到菌丝转变期间，CaYck2p通过使转录因子uMe6 mRNA表达增加，其下游菌丝特异性基因ALS3、HWP1和SUN41表达下调来调节酵母菌形态发生、生物膜形成和对宿主细胞的损伤。增强菌丝生长基因(enhanced filamentous growth，efg)1通过调节 RME1、STE12 基因的表达调控菌丝的形成及酵母菌细胞的形态转换，与生物膜形成密切相关[9]。

在表皮葡萄球菌生物膜的形成过程中，表皮葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白(fibrinogen binding protein，fbe)基因编码的纤维蛋白原结合蛋白(Fbe)、细胞间黏附素A (intercellular adhesion gene，ica) 基因编码的多糖胞间黏附素(polysaccharide intercelluar adhesion，PIA)、聚集相关蛋白(accumulation associated protein,aap)基因编码的聚集相关蛋白(Aap)等多种因子均有参与。

在黏附阶段，fbe基因编码合成的Fbe与宿主纤维蛋白原相结合，使表皮葡萄球菌黏附于生物材料表面，从而介导生物膜形成[10-11]。在细菌增殖和聚集阶段则通过PIA、Aap等蛋白起作用。Ica基因在表皮葡萄球菌生物膜感染中起重要作用，其编码的蛋白PIA是表皮葡萄球菌生物膜形成聚集阶段的必需物质[12]，可促进BF三维立体结构的形成并增强BF耐药性，是目前发现的与表皮葡萄球菌致病性关系最为密切的因子[11]。表皮葡萄球菌生物膜的形成是个动态过程，首先由细菌表面疏水性蛋白或细胞外多糖对生物材料初始附着，随后细菌通过PIA介导相互聚集，形成BF。扫描电镜观察发现，ica操纵子阳性表皮葡萄球菌在PVC材料表面可形成结构致密、高度组织化的BF结构；而ica操纵子阴性表皮葡萄球菌在PVC材料表面只有部分细菌附着，无成熟BF结构形成。这可能是因为后者含初始黏附相关基因(atl E、fbe)，表现为初步黏附，但缺乏ica操纵子介导BF聚集，因而未能形成成熟的BF。

Aap是一种以锌依赖的方式自组装的细胞壁锚定蛋白，介导生物膜内的细胞间黏附，促进生物膜增厚并成熟[13]。细胞壁锚定蛋白附着点附近存在低复杂性区域，Aap蛋白的C终端部分包含一个135 aa长的脯氨酸/甘氨酸富集区(PGR)，该区域包含一组18个几乎相同的AEPGKP重复序列。利用生物物理技术对PGR分析表明，该区域是一种高度扩展、本质上无序的多肽，具有异常高的多聚脯氨酸Ⅱ型螺旋倾向。用超离心法分析和动态光散射法测定表明，PGR在溶液中的整体构象状态与温度有最小的依赖关系。PGR在加入渗透剂三甲胺N-氧化物或助溶剂2，2，2-三氟乙醇时，具有抗构象崩解或α-螺旋形成的能力。这些结果表明，PGR是一种有弹性的、延伸的长柄，可以从细菌细胞壁向外延伸，促进生物膜内细菌间的黏附，说明Aap作为聚集阶段的一个重要因子，在生物膜形成中发挥一定作用。

PAHARIK等[14]研究表明，Aap的作用独立于PIA，Aap在发挥细胞间黏附作用时需要蛋白水解及裂解，金属蛋白酶SepA调控着与堆积相关的蛋白质处理和表皮葡萄球菌细胞间黏附的表面特性，应用重组蛋白研究表明，SepA能够在335残基处裂解Aap的A区域，在601残基处裂解A、B之间的区域，进而使Aap发挥作用。在PIA阴性的表皮葡萄球菌1457Δica，金属蛋白酶SepA对Aap依赖的表皮葡萄球菌是必需的。调节剂SarA抑制SepA的活性，sarA失活会增加SepA的产生，反过来增强生物膜的形成。因此，在aap基因介导的生物膜成熟过程中，分泌葡萄球菌蛋白酶是生物膜形成的一个重要因素。

研究者通过建立表皮葡萄球菌和白色念珠菌混合生长的体外生物膜模型研究表明，混合培养能形成比单一微生物结构更复杂的混合生物膜，在混合生物膜形成过程中，存在细菌与真菌不同水平的相互作用，使表皮葡萄球菌icaA、fbe、aap基因表达上调，PIA、Fbe、Aap蛋白生成增加;白色念珠菌als3、hwp1、efg1基因表达上调，相应蛋白表达增加。表皮葡萄球菌和白色念珠菌同时存在于生物材料表面后，表皮葡萄球菌黏附在白色念珠菌菌丝及孢子表面，混合生物膜较单一微生物生物膜更厚、生长动力学更高，结构更致密、更复杂。

2.2密度感应与生物膜细菌和真菌可以通过合成和释放细胞外信号分子即密度感应分子(quorum sensing molecule，QSM)以改变相邻细胞间的信号传递来调节自身的活动[15]。白色念珠菌酵母态和丝状体生长两种形式相互转化的能力对其致病性非常重要。QSM在生物膜的生长和调控中起着重要的作用，这些分子有一种独特的作用机制，它们在细胞生长过程中不断地产生与细胞质量成正比的物质，导致QSM靶基因的协同表达。用高浓度的法尼醇孵育白色念珠菌几乎完全抑制生物膜的形成。法尼醇也能减少表皮葡萄球菌生物膜的生成[16]。法尼醇通过抑制Ras蛋白通路，诱导白色念珠菌凋亡；通过下调丝裂原活化蛋白(mitogen-activated protein，MAP)激酶和PKA(cAMP-protein kinase A)激酶通路来来抑制细菌胚管的形成，诱导菌丝向孢子转变以抑制菌丝形成，影响真菌的形态[17]。近年来研究表明，法尼醇在白色念珠菌生成的起始阶段，通过对翻译和转录成分的调控，即针对真核起始因子2B (eIF2B)，影响其mRNA与小核糖体亚基的相互作用，降低启动核糖体复合物的水平，通过在翻译途径上的不同步骤抑制菌丝的合成，抑制白色念珠菌的丝状生长[18]。王小燕等[19]通过荧光定量PCR研究表明，用法尼醇处理过的混合生物膜中表皮葡萄球菌生物膜形成相关基因icaA、aap、fbe和白色念珠菌生物膜形成相关基因als3、hwp1、efg1的表达均下调，进而影响生物膜的形成。

3 耐药机制

生物膜的形成与抗真菌药物的耐药性密切相关。研究表明，在生物膜形成的第48小时，生物膜内的白色念珠菌与浮游细胞相比，对抗真菌药的耐药性增加了5～8倍，这种耐药性的增加是很多因素综合作用的结果[20]。

3.1渗透屏障生物膜由细胞外基质(extracellular matrix，ECM)及被其黏结的细菌组成。ECM主要由多糖、蛋白质和核酸组成，有助于生物膜的形成，保护生物膜的结构，维持细胞之间和细胞表面与环境之间稳定的相互作用。胞外多糖(extracellular poly saccharide，EPS)是组成生物被膜结构的基质物,其中β-葡聚糖能够绑定氟康唑和两性霉素B，阻止药物渗透到生物膜；碱溶性多糖(alkali-soluble polysaccharides，ASPs)则对抗真菌药物起螯合作用或阻隔作用。胞外DNA(eDNA)是真菌和BF的关键基质成分，能够附着在不同的表面，与其他大分子物结合，使生物膜具有结构完整性和稳定性，DNA产物的增加促进了念珠菌生物膜的成熟及对抗真菌药物的能力[21]。但混合生物膜内表皮葡萄球菌的EPS基质过量产生会干扰菌丝之间的黏附，增加生物膜的毒性和耐药性[22]。

3.2耐药基因表达白色念珠菌ATP结合转运蛋白超家族(ATP-binding cassette，ABC)构成一个多基因耐药家族，其中白色念珠菌耐药(Candida drug resistance，CDR)基因CDR1、CDR2 和多药耐药(multidrug resistance，MDR)基因MDR1 的过度表达是白色念珠菌耐药的重要机制之一，它们的过度表达可将进入白色念珠菌细胞内的药物泵出细胞外，起抗生素外排泵的作用。在白色念珠菌生物膜形成的早期阶段，CDR和MDR基因表达上调，这种上调对抗真菌耐药性的形成是非常重要的，随着生物膜的成熟，甾醇成分的变化似乎更相关，且耐药性不仅仅依赖于一个单一的机制。近年来研究发现，在生物膜内部也发现一种持久细胞，该细胞是一种休眠的、对抗菌药物具有高度耐受性的非分裂细胞。收集幸存的持留菌细胞再培养后，药敏实验显示其最低抑菌浓度(MIC)并没有增髙；并可以形成新的生物膜，再次接受高浓度抗真菌药物冲击后，绝大多数真菌细胞仍然被杀灭，仅有与原始菌株相似水平的极少数持留菌细胞幸存。白假丝酵母菌持留菌是具有多药耐药性，不具备遗传特性的表型变异细胞，被认为是生物膜耐药的主要原因[23]。培养这些生物膜中的持续细胞能检测出CDR基因的表达[19]。ABC蛋白参与真菌交配因子和聚量感应分子的分泌,这些分子会影响生物膜的结构和行为，从而导致耐药性的增加[24]。在混合生物膜中，细菌真菌之间不同水平互相作用，使表皮葡萄球菌生物膜形成相关基因icaA、fbe、aap表达上调，从而使生物膜在形成过程中的黏附聚集能力增强，ECM增厚，这是耐药性增强的一个重要原因。生物膜形成时发生接触诱导表达及转录活性的改变,使更多的基因表达，导致生物膜形成过程中白色念珠菌及表皮葡萄球菌代谢增强,耐药性增加[10]。