脂多糖诱导Kupffer细胞激活、焦亡及耐受机制研究进展*

谭定勇，秦凡博 综述，程 瑶，龚建平△ 审校

(1.重庆市万州区人民医院普外科 404000；2.重庆医科大学附属第二医院肝胆外科 400010)

Kupffer细胞是一类定植于肝脏中的巨噬细胞，是人体巨噬细胞中最大的一个群体，它的主要功能为吞噬病原菌、微生物、坏死细胞碎片及作为抗原呈递细胞发挥作用。由于肝脏解剖位置的特殊性，使得其长期暴露于肠道来源的各种病原微生物环境中，因此，Kupffer细胞便组成了肝脏在面对各种病原微生物时的第一道屏障，因为其特殊的功能使得它在先天免疫系统及获得性免疫系统中占据着重要的地位[1]。Kupffer细胞中可以表达多种模式识别受体(PRRs)，如表达在细胞膜上的Toll样受体(TLRs)，细胞质中的Nod样受体(NLRs)等，可以对细胞内或细胞外各种病原相关模式分子及危险相关模式分子进行识别，进而被激活。革兰阴性菌的细胞壁脂多糖(LPS)为内毒素的主要构成，它是众多可以激活Kupffer细胞使其发挥特定功能的物质中最经典的一类，LPS既往对于Kupffer细胞激活的研究多是聚焦于其依赖的TLRs途径，近年来在关于巨噬细胞的研究上，发现了另外一种非TLRs依赖的信号通路，而这条信号通路的激活依赖于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶11(caspase-11)并会伴随炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-18的释放，细胞本身经此途径激活后则会发生一种炎症形式的细胞死亡即细胞焦亡。Kupffer细胞的激活与内毒素耐受的现象有很大联系，因为内毒素耐受依赖于各种调节因素对Kupffer细胞激活通路上各个环节的精密调控，这其中包括了许多负性调节蛋白的表达改变，以及近年来广受关注的肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)泛素化修饰和非编码RNA在其中的作用。

1 LPS诱导Kupffer细胞激活的信号通路

1.1细胞外LPS激活Kupffer细胞的信号通路 Kupffer细胞可以被多种刺激物激活，如革兰阴性菌的细胞壁LPS、细菌及真菌的β葡聚糖、补体因子C3a和C5a等,激活的Kupffer能够上调多种炎症介质如IL-6、IL-12、IL-18、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及干扰素-γ(INF-γ)等[2]。在这些众多的激活Kupffer细胞的刺激物中，LPS是最为经典且研究得最深入的一种，LPS主要通过作用于TLRs家族中的TLR4起到激活细胞的作用。Toll蛋白最早是在20世纪90年代果蝇体内发现的一种参与天然免疫反应的蛋白，与果蝇类似，人类细胞中的TLRs是一种Ⅰ型跨膜蛋白，它可以广泛识别各种病原体相关模式(PAMPs)，如细菌、病毒的DNA、RNA及真菌等，是机体天然免疫的重要组成成分。在人类细胞中，被证实的TLRs有10种，肝脏中Kupffer细胞、内皮细胞、肝星状细胞及肝实质细胞等均大量表达TLRs。LPS引起的TLR4通路的激活方式目前大多认为是以下过程：血浆中的脂质结合蛋白(lipid-binding protein,LBP)与LPS相结合，将LPS运输到与锚定在脂质膜上脂筏区域中的CD14相结合，CD14将LPS转运并与髓样分化因子2(myeloid differentiation factor 2,MD2)相结合，最终形成TLR4/MD2复合物的二聚体，二聚体的形成是炎症开始的第一步[3]。最近，LI等[4]揭示了一种影响TLR4活性的新机制，T3JAM(TRAF3-interacting JNK-activating modulator，T3JAM)可以作为一种分子钳来“收紧”TLR4，促进其向脂筏区域易位，最终增强巨噬细胞介导的炎症。LPS通过与TLR4和MD-2作用形成的复合体随后会活化髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88)依赖的下游通路或形成TLR4的内吞体。一方面，MyD88被募集后进一步招募白细胞介素受体相关激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase,IRAK1)、IRAK2、TNF受体相关因子(TNF receptor-associated factor 6,TRAF6)等蛋白形成蛋白复合物，最终这个蛋白复合物可以分别激活核因子-κB(NF-κB)及JNK/p38 MAPK信号通路；另一方面，除了依赖于MyD88激活NF-κB和JNK/p38 MAPK通路外，LPS被转位进入TLR4的内吞体内，随后招募TRIF、TRAF3及其他蛋白，使得INF调节因子IRF3发生磷酸化，最终上调(INF-Ⅰ)的表达[5]。

1.2细胞内LPS激活Kupffer细胞的信号通路 Kupffer细胞虽为人体主要的巨噬细胞群体，但专门针对细胞内LPS激活Kupffer细胞的信号通路相关研究仍较少，但一些对于LPS感染巨噬细胞的相关研究却能提示Kupffer细胞中也可能存在类似激活途径。既往很长一段时间研究者们认为LPS只能在细胞外作用于TLRs激活巨噬细胞，然而，KAYAGAKI等[6]最早发现当小鼠巨噬细胞感染某些革兰阴性菌如大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、福氏志贺菌后，会出现一种依赖于caspase-11的炎症因子释放，而且caspase-11可以杀死巨噬细胞内从囊泡逃逸出的这些细菌。这些现象说明了这些革兰阴性菌可能通过某个相同的病原体相关模式分子能够激活caspase-11。caspase-11在正常状态下的细胞中表达常较低，但可以使用不同的TLRs激动剂诱导caspase-11在细胞内表达升高，因此，HAGAR等[7]和KAYAGAKI等[8]用不同的TLRs激动剂预处理Kupffer细胞后，使用电穿孔的方法，将革兰阴性菌共有的成分LPS转染进细胞，发现caspase-11被激活，此外，KAYAGAKI等[8]还发现了是LPS的脂质A成分作用于caspase-11的CARD结构域才可以将其激活。因此，这两个独立的实验均证明了细胞内的LPS依赖于caspase-11可以激活Kupffer细胞。另外，在LPS是如何进入Kupffer细胞这个问题上，又有许多学者展开了研究。有观点认为，细胞内的鸟苷酸结合蛋白可以通过对包含革兰阴性菌的囊泡及包含LPS的外膜囊泡(out-membrane vesicles,OMVs)进行裂解使LPS在细胞内定位[9]。最近，DENG等[10]发现在脓毒血症中，高迁移率族蛋白1(HMGB1)可以结合LPS通过晚期糖基化终产物(RAGE)受体进入细胞质，随后通过溶酶体的作用使LPS在细胞质中释放出来[10]。除此之外，还有研究者认为LPS进入细胞可能还与LBP有关，因为他们发现当细胞外LPS浓度升高时，细胞质内的LPS-LBP复合物也会随之升高，但LBP介导LPS进入细胞的具体机制仍有待探索[11]。当细胞内的LPS或革兰阴性菌激活caspase-11后，会产生两方面的效应：一方面，活化的caspase-11可以介导Kupffer细胞发生炎症的程序性死亡，即细胞焦亡；另一方面，它可以通过激活核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白-凋亡相关颗粒样蛋白(NLRP3-ASC)复合体激活caspase-1，从而使炎症因子IL-1β、IL-18成熟释放。由于既往的关于NLRP3经典炎症小体的激活与此激活途径有很大差别，故也将此条途径称之为非经典NLRP3炎症小体激活通路。现普遍认为由caspase-11激活引起的钾离子外流是最关键的因素[12]。YANG等[13]发现，活化的caspase-11可以通过切割细胞膜上的pannexin-1蛋白使钾离子外流及ATP释放，钾离子外流使NLRP3/ASC/caspase-1通路激活，而ATP释放则与焦亡相关。除钾离子外，溶酶体中的组织蛋白酶B的释放也与NLRP3非经典炎症小体通路的激活相关， CHEN等[14]发现在Kupffer细胞中，LPS可能会使溶酶体膜结构的稳定性遭到破坏，使其中的组织蛋白酶B从中释放，而组织蛋白酶B的释放使caspase-11的激活增强，从而通过上述途径激活非经典NLRP3炎症小体，但LPS是如何影响溶酶体膜的结构还有待进一步探索。

2 细胞内LPS诱导的Kupffer细胞焦亡

细胞内LPS通过上述信号通路将巨噬细胞或Kupffer细胞激活之后，除了能够分泌多种炎症介质参与促炎或抗炎反应外，这些细胞内LPS还可以诱导巨噬细胞发生一种炎症形式的程序性死亡，即细胞焦亡。焦亡分为2条途径：经典焦亡途径与非经典焦亡途径，而细胞内的LPS或革兰阴性菌诱导的Kupffer细胞焦亡属于非经典焦亡途径。以往的研究者不清楚caspase-11(在人类细胞中则为caspase-4/5)的下游关键分子机制，以至于无法很好解释LPS介导的Kupffer细胞死亡。KAYAGAKI等[15]和SHI等[16]通过不同的方法找到了焦亡下游的关键分子Gasdermin D(GSDMD)。KAYAGAKI等[15]通过小鼠基因的大量变异去筛选与caspase-11介导的焦亡相关的基因；SHI等[16]通过基因编辑技术找到了caspase-1和caspase-11介导的焦亡下游的共同分子。他们发现，被激活的caspase-11会去切割这个分子，从而使该分子的N端从自我抑制的C端中释放出来，释放出的N端是细胞发生焦亡的关键。随后，DING等[17]又说明了N端导致细胞死亡的原因[17]，他们发现被切割下来的N端可以结合脂质膜并能在细胞膜上形成由16个单元围成的直径约为10～14 nm的孔洞，因渗透压的作用从而引起细胞肿胀死亡。除GSDMD介导的焦亡外，YANG等[13]发现，pannexin-1和P2X7对于Kupffer细胞的焦亡也至关重要，因为在缺乏这两个蛋白时细胞内的LPS诱导的细胞焦亡程度会减弱，并且野生型小鼠相较于这两个基因被敲除后的小鼠更容易在LPS的刺激下死亡，机制上解释为，激活的caspase-11切割pannexin-1使ATP释放，ATP的释放作用于细胞膜上的P2X7，从而使非选择性阳离子通道开放，诱发细胞焦亡。

细胞焦亡作为一种炎症形式细胞死亡的方式，可以通过杀灭感染细胞及释放炎症因子两个手段达到使感染局限以抵抗感染的作用，除此之外，通过细胞内LPS激活非经典NLRP3炎症小体通路也能使炎症因子的释放增多。现在认为焦亡主要发生在一些具有吞噬功能的细胞中，比如Kupffer细胞、树突状细胞、内皮细胞等[18]，而Kupffer细胞作为人体巨噬细胞中最大的一个群体，专门针对Kupffer细胞的焦亡或是炎症小体通路的研究却相对较少。因此，若进一步理解焦亡和炎症小体在Kupffer细胞中的作用，可能会为感染相关的疾病如脓毒血症、内毒素休克等提供新的治疗靶点。

3 Kupffer细胞内毒素耐受机制的研究进展

3.1内毒素耐受概念及TLRs通路上的负性调控因子 内毒素耐受指的是，当预先给予小剂量的LPS刺激之后，在随后的大剂量LPS作用下，机体会表现出较低的炎性反应或是不表现出炎性反应的现象。这种现象与许多脓毒血症患者感染的后期发生免疫麻痹在原理上有许多的相似之处。肝脏长期暴露在来源于肠道微生物刺激的环境下，却不表现明显炎症，其中，Kupffer细胞的内毒素耐受发挥着至关重要的作用。内毒素耐受时可以发生TLRs受体的下调、信号分子的改变、转录因子的负性调控及染色质的组蛋白修饰[19]等。在TLR4信号通路的各个环节上，内毒素耐受会使TLR4表达下调、TLR4对MYD88及TRIF招募的降低、IRAK1/4的活性降低及通过形成无活性的p50二聚体影响NF-κB活性[20-21]。除此之外，还包括一些作用于此条通路中负性调节因子的上调，现已被证实的包括Pellinon3负性调控TLR4/TLR2信号通路、IRAK-M抑制IRAK1/IRAK4激酶、SHIP1抑制JNK和p38磷酸化从而抑制MAPK信号通路、SCOS1负调控TLR4/MYD88通路、Twist-2阻断NF-κB促炎症转录等[22-26]。

3.2TRAF3的泛素化修饰在Kupffer细胞内毒素耐受中的作用 TRAF3为肿瘤坏死因子受体家族成员之一，其生物学功能依赖于它的K48泛素化降解及K63自身泛素化激活，由于它在内毒素耐受中可以影响JNK/p38 MAPK通路及TRIF通路[27]，因此对于TRAF3泛素化修饰在内毒素耐受中相关的研究近年来有不少的报道。LI等[28]发现，内毒素耐受时MAPK通路发生了重编程，机制上是通过Pellinon1介导的cIAP2的K63泛素化抑制及TRAF3的K48泛素化降解的抑制来实现，并且还在胆管炎患者体内也验证了Pellinon1的上调及TRAF3的下调的现象。同一个团队中的WEN等[29]也发现了在Kupffer细胞内毒素耐受时USP25这种专门针对TRAF3的去泛素化酶表达会出现上调，然后通过抑制TRAF3的K48泛素化连接从而抑制其降解，最终抑制MAPK通路实现内毒素耐受。

3.3非编码RNA对TLRs信号通路的调控在Kuffer细胞内毒素耐受中的作用

3.3.1微RNA(microRNA,miRNA)对Kuffer细胞内毒素耐受的调控 miRNA为一类长度约为22个核苷酸的非编码小RNA，可以与mRNA非翻译区的3′端的多个位点结合，起到对mRNA转录后的负性调控作用。近年来，研究者发现miRNA对于TLRs信号通路的调控在内毒素耐受中十分重要。如miRNA-98(miR-98)可以抑制IL-10的分泌，而在Kupffer细胞内毒素耐受时，miR-98下调，从而使对IL-10翻译的抑制减弱[30]。miR-221、miR-579和miR-125b均可以对TNF-α进行抑制，其中miR-221促进TNF-α降解，miR-579和miR-125b抑制TNF-α转录[31]。另有研究表明miR-146α和miR-155可以同时通过染色质的三维空间对同一个基因共同定位，用相同的转录机制和相似的对Histone3甲基化谱的作用共同调节内毒素耐受的形成[32]。SEELEY等[33]通过对免疫耐受相关的miRNA的筛查发现，miR-221和miR-222可以通过依赖于SWI/SNF和STAT介导的染色质重塑，调节Brg1基因，使得一系列炎症因子相关的基因转录沉默，从而达到免疫耐受的状态，且脓毒症患者免疫麻痹的发生也被证实伴随着miR-221/222的表达升高。

3.3.2长链非编码RNA(LncRNA)对内毒素耐受的调控 LncRNA是一类长度超过200个核苷酸不编码蛋白的调节RNA，与miRNA多在转录后水平调控的专一机制有所区别，LncRNA可以在多个水平上用多种机制参与生理病理过程的调控。LncRNA的表达谱在LPS激活TLRs通路时发生了很大的变化。DU等[34]发现，LncRNA Mirt2可以在LPS刺激后的Kupffer细胞中起到负性调节TLR信号通路的作用，它是通过抑制TRAF6的K63泛素化从而影响NF-κB及JNK/p38 MAPK通路，抑制炎性反应。在LPS诱导的炎性反应中，LncRNA MALAT1可以与NF-κB在核内作用，抑制TNF-α、IL-6的表达水平[35]。除此之外，最近也有研究发现，TLR4信号通路的耐受可以逆转LPS诱导的LncRNA PCGEM1、LncRNA HOTTIP的抑制及LncRNA snaR的上调，但这些LncRNA在免疫耐受状态下的具体作用还有待探索[36]。总之，有许多LncRNA的变化都可以调节TLRs信号通路的重编程，但大多数LncRNA的表达及它们的功能在内毒素耐受中的作用尚未得到验证，可以预见，这些LncRNA在Kupffer细胞内毒素耐受时的作用及机制也将成为以后的研究热点。

4 总结与展望

Kupffer细胞其数量庞大且功能复杂，LPS刺激Kupffer细胞后可以通过多种信号通路将其激活，这些被激活的信号通路的改变对于Kupffer细胞的焦亡及Kupffer细胞介导的内毒素耐受有着十分重要的作用。细胞焦亡的相关研究虽然大多数并没有专门集中在Kupffer细胞当中，但是也可以从其他类型的细胞如单核Kupffer细胞、树突状细胞、神经胶质细胞中寻找有关于Kupffer细胞焦亡的线索。Kupffer细胞内毒素耐受的研究在蛋白质翻译后修饰及非编码RNA等领域取得一些进展。总之，对于Kupffer细胞激活、焦亡及内毒素耐受机制的研究，将会为解决某些临床问题如脓毒症、肝脏移植免疫耐受及肝脏肿瘤等提供新的理论支持。