miRNAs在破骨细胞中的研究进展

邓亚军,解琪琪,李文洲,史卫东,马靖琳,潘云燕,康学文,汪 静*

(1.兰州大学第二医院骨科,中国甘肃兰州730030;2.甘肃省骨关节疾病研究重点实验室,中国甘肃兰州730030;3.兰州大学第二医院,中国甘肃兰州730030)

miRNAs是—类内源性非编码小RNA,长度一般为21～23个核苷酸[1],在基因表达调控中具有重要的作用。miRNAs主要通过参与基因的转录后调控实现对靶基因的表达调控,在肿瘤发生发展、生物发育、器官形成、病毒防御、表观调控以及代谢等方面都发挥着重要作用[2]。据估计,miRNAs占人类基因组的1%～5%[3],高达60%的蛋白质编码基因在转录后水平受到miRNAs的调控,其调控方式主要为抑制mRNAs翻译或诱导mRNAs降解[4]。

破骨细胞起源于单核髓性造血干细胞[5],是体内唯一负责骨吸收的细胞,其与成骨细胞共同作用,在骨代谢平衡的调控中发挥着重要作用。许多骨骼疾病的发生发展都与破骨细胞有着紧密的联系[6],如:破骨细胞活性增强会引起骨吸收增多进而导致骨质疏松症;类风湿关节炎中破骨细胞是骨侵蚀发生的关键环,因此研究清楚破骨细胞分化形成的调节机制对于解决临床问题具有重要意义。破骨细胞的分化形成过程受多种细胞因子及转录因子的调控,近年来研究人员发现许多miRNAs在破骨细胞分化形成过程起着重要调控作用,故本文对影响破骨细胞分化形成的相关miRNAs进行综述,为后续相关研究提供新思路。

1 miRNAs概述

miRNAs是一段由21～23个核苷酸构成的高度保守的内源性非编码小分子RNA,其在细胞增殖、分化、代谢及凋亡等不同生物学过程中发挥着重要作用,是脊椎动物发育过程中不可或缺的部分[7]。1993年,Lee等[8]首次发现控制秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)幼虫发育的基因lin-4编码两个核苷酸长度分别为22和61的小RNA,它们含有与lin-14 mRNA的3′非翻译区(3′-untranslated region,3′-UTR)互补的序列;与此同时,Wight-man等[9]研究表明 lin-4 RNA 与 lin-14 3′-UTR中的多个位点杂交可以抑制lin-14翻译而不影响lin-14 mRNA的水平,表明lin-4 RNA在基因表达的转录后调节中起重要作用。由于lin-4 RNA的功能在秀丽隐杆线虫及其他物种中被逐渐发现,因此学者们就把这一类小调控RNA称为 miRNAs[10～11]。

1.1 miRNAs的产生

经典的miRNAs成熟途径如下:miRNAs相关基因由RNA聚合酶Ⅱ或RNA聚合酶Ⅲ转录后形成初级miRNAs(pri-miRNAs),这个时候的miRNAs长达几千个核苷酸。随后,微处理复合物Drosha-DGCR8将pri-miRNAs裂解成前体miRNAs(pre-miRNAs),这时候形成了发卡结构。以上过程是在核内进行的。接着,pre-miRNAs由exportin-5-Ran-GTP复合物转运到细胞质中,被RNase Dicer酶分解成长度为21～23个核苷酸的成熟 miRNAs[12]。此时 miRNAs可与 mRNAs的 3′-UTR或其他位点中的互补序列结合以抑制蛋白质翻译或诱导mRNAs降解[13]。

1.2 miRNAs的作用机制

miRNAs主要通过翻译抑制及mRNAs降解两种作用方式在基因表达的转录后调控中发挥重要作用[13～14]。miRNAs通过其 5′端的 seed 序列与靶mRNAs的6～7个碱基连续互补结合,可导致miRNAs在蛋白质翻译水平上抑制靶基因表达,此种作用方式在哺乳动物中比较普遍[15]。miRNAs也有可能影响mRNAs的稳定性,如果miRNAs与靶位点完全互补或者几乎完全互补,那么这些mi-RNAs的结合往往会引起靶mRNAs的降解,这种情况在动物、植物中比较常见[16]。通过这种机制作用的miRNAs的结合位点通常都在mRNAs的编码区或开放阅读框中。一个miRNA可以有多个靶基因,而多个miRNAs也可以调节同一个基因[17～18],这种网络调控关系使miRNAs具有更为复杂的功能。

2 miRNAs与破骨细胞

破骨细胞是体内一种负责骨吸收的骨特异性多核细胞,来源于造血干细胞,其分化受多种细胞因子和转录因子的调控,其中NF-κB受体激活蛋白配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)是破骨细胞分化的最重要因素[19～21]。此外,有研究表明,破骨细胞前体中miRNAs活性的完全丧失会促进成熟破骨细胞形成[22];另有研究报道,在单核破骨细胞前体和成熟多核破骨细胞中,miRNAs生物合成关键酶的特异性缺失会引起破骨细胞数量减少和活性降低,进而导致骨量增加[23～24]。由此可知,miRNAs在破骨细胞分化形成过程中发挥着重要作用。一项小鼠研究表明,从破骨细胞分化的早期到晚期,共有49个miRNAs上调,44个miRNAs下调,同时该研究团队通过实验验证了在破骨细胞分化形成过程中,两种高度上调的miRNAs,即miR-365和miR-99b,通过靶向细胞和细胞外基质之间的相互作用、轴突导向、黏着斑和肌动蛋白细胞骨架的重塑,调控成骨细胞分化,由此可以看出多种miRNAs参与破骨细胞分化的调控[25]。

2.1 促进破骨细胞形成的miRNAs

与破骨细胞形成相关的miRNAs中,miRNA-21 一直是被广泛研究的对象[26～27]。Sugatani等[22]研究发现,miRNA-21在破骨细胞前体中高表达,在破骨细胞分化形成过程中表达水平明显上调。转录因子c-fos和pU.Ⅰ是破骨细胞形成的关键调控因子,他们通过作用于特定的启动子触发miRNA-21的转录,与此同时,miRNA-21能够下调对c-fos发挥抑制作用的程序性细胞死亡因子4蛋白(programmed cell death 4,PDCD4)的表达水平。由此可知,c-fos/miRNA-21/PDCD4形成了调控关系,共同促进RANKL诱导的破骨细胞的分化形成[22]。

多项研究表明miRNA-29家族(miRNA-29a-3p,miRNA-29b-3p,miRNA-29c-3p)是调控破骨细胞形成的关键分子。在来源于骨髓单核细胞(bone marrow monocytes,BMMs)及巨噬细胞系RAW264.7的破骨细胞分化形成过程中,所有miRNA-29家族成员的表达量都升高,当他们被敲除后,破骨细胞前体的定型和迁移受到抑制,但并不干扰成熟破骨细胞的功能[28]。Wang等[29]研究表明,miRNA-29家族成员对破骨细胞分化形成的刺激作用主要由靶蛋白核因子I-A(nuclear factor IA,NFIA)转录后抑制介导,其中,NFIA是M-CSF受体的负调控因子。破骨细胞中的miRNA-29靶蛋白还包括降钙素受体和关键的细胞骨架组织,例如:细胞分裂控制蛋白42和G蛋白偶联受体85[30]。需要指出的是,也有学者得出与上述相互矛盾的结论,其研究结果表明,用pre-miRNA-29a能够显著改善糖皮质激素诱导的大鼠骨量丢失,同时可以抑制miRNA-29在体外增加骨吸收的作用[31～32]。以上研究证据说明,miRNA-29家族中一部分成员对破骨细胞活性和骨重塑具有较为复杂的调控作用。

miRNA-31是与破骨细胞形成相关的另一个miRNA,其广泛表达于具有超过200个潜在靶点的多种组织中[32]。有研究表明,miRNA-31在RANKL诱导的破骨细胞发生过程中被高度上调,在小鼠骨髓细胞中高达18倍,其特定的miRNA抑制剂能够抑制终末破骨细胞形成和骨吸收[33],这种作用可能与RhoA的靶向作用有关,RhoA在破骨细胞分化形成中起着关键的成环作用。此外,其他研究也证实miRNA-31对破骨细胞形成具有促进作用[34]。

在人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)来源的破骨细胞形成过程中,人们通过分析其miRNAs表达谱,证实miRNA-148a对破骨细胞的分化形成具有促进作用,推测这可能是由v-maf肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物B(v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B,MAFB)的负调控介导[35]。当给去卵巢(ovariectomized,OVX)小鼠注射miRNA-148a阻断剂后,可观察到骨吸收被抑制,而且骨量增加[35]。

破骨细胞生成的其他正调控因子还包括mi-RNA-183及miRNA-214。miRNA-183通过抑制血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)的表达正调控破骨细胞的分化形成[36]。Zhao等[37]研究表明,miRNA-214能够增强破骨细胞活性并降低骨密度,其作用机制可能为miRNA-214通过靶向磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,Pten)/PI3k/Akt通路对破骨细胞生成进行调控。

2.2 抑制破骨细胞形成的miRNAs

根据当前的文献报道可知,miRNA-7-5p、miRNA-26、miRNA-34、miRNA-124、miRNA-125a、miRNA-146a、miRNA-155、miRNA-218-5p 及miRNA-503在破骨细胞形成中表现出抑制作用[38]。miRNA-124和miRNA-218-5p是破骨细胞发生的主要调控因子,也可以作为活化T-细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells c1,NFATc1)的内源性负调控因子;miRNA-7-5p和miRNA-26作用于NFATc1上游,通过抑制树突状细胞特异性跨膜蛋白(dendritic cell-specific transmembrane protein,DC-STAMP)进而阻止破骨细胞前体融合形成成熟的破骨细胞。Guo等[39]研究指出,在MCSF和RANKL诱导的破骨细胞发生过程中,miRNA-125a表达显著下调,而miRNA-125a过表达时则会抑制破骨细胞的分化形成;相反,通过转染实验抑制miRNA-125a的表达则促进破骨细胞的发生过程。肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)是RANKL/RANG/NFATc1信号的转导因子,已被证实是miRNA-125a的作用靶点。体外实验表明,NFATc1能够减少miRNA-125a的转录,从而提示破骨细胞内存在TRAF6/NFATc1/miRNA-125a调节反馈回路[40]。

此外,干扰素 β (interferon beta,IFN-β)可在RANKL/RANK信号转导级联反应的下游通过cfos依赖性机制在破骨细胞分化期间被诱导产生,并且IFN-β的增加可反过来抑制破骨细胞产生[41]。Zhang等[42]的实验研究发现,miRNA-155是由IFN-β诱导产生的miRNA,其通过靶向细胞因子信号转导抑制因子1(SOCS1)和小眼畸形相关转录因子(MITF)这两种破骨细胞调控因子,进而介导IFN-β对破骨细胞分化的抑制作用。Nakasa等[43]对mi-RNA-146a在破骨细胞生成中的作用进行了体内和体外实验研究,结果表明,miRNA-146a能够抑制M-CSF和RANKL诱导的破骨细胞的分化形成,而静脉注射miRNA-146a可在胶原诱导的关节炎小鼠模型中防止骨侵蚀。

2.3 破骨细胞相关的其他miRNAs

在破骨细胞相关的其他miRNAs中,miRNA-34a在物种间高度保守,并在BMMs及PBMCs来源的破骨细胞分化期间表达下调[44]。在破骨细胞中特异性表达miRNA-34a的转基因小鼠表现出骨吸收量减少和骨密度增加,而在miRNA-34a敲除的小鼠模型中观察到与之相反的表型[45]。此外,采用miRNA-34a纳米颗粒治疗OVX诱导的骨质疏松症后,骨质疏松症状得到有效缓解,这进一步证明miRNA-34a可以成为抑制破骨细胞活性和骨质流失的重要目标[45]。从分子学角度来看,由于转化生长因子-β诱导因子2(transforming growth factor β induced factor homeobox 2,TGIF2)具有促破骨细胞生成的作用,因而被认为是miRNA-34a的直接靶点。与此假说一致,TGIF2缺失可减少骨吸收,而且miRNA-34a会失去对破骨细胞的调控作用。有研究证明miRNA-503是通过直接抑制RANK而作用于破骨细胞的miRNA[46]。事实上,在OVX小鼠模型中,使用特异性miRNA抑制剂沉默miRNA-503后,RANK蛋白表达量增加,进而促进骨吸收,使骨量减少,而miRNA-503的过表达则会抑制骨吸收,有助于防止骨量丢失。

尽管很多实验研究都对miRNA-223的功能进行了验证,但其对破骨细胞的分化形成是促进还是抑制作用仍有争议[32,47]。miRNA-223几乎全部在造血系统中表达,包括髓系细胞谱系和单核破骨细胞前体。一些体外研究表明,miRNA-223受转录因子PU.Ⅰ调控,其在破骨细胞生成过程中表达量明显增加,同时也作为对M-CSF刺激的应答在破骨细胞前体中表达。Franceschetti等[25]的研究表明,miRNA-223通过抑制核因子I-A(NFIA)的表达,从而增强破骨细胞的分化形成;当miRNA-223表达水平受到抑制时,破骨细胞的分化及骨吸收活性降低。然而,与上述结论相反,另有研究指出,在miRNA-223过表达的情况下,PBMCs及RAW264.7细胞来源的破骨细胞的分化形成被抑制[32,47]。这种效应可能通过核因子κB抑制物激酶α(inhibitor of nuclear factor kappa B kinase-α,IKKα)的下调介导,而IKKα是非经典NF-κB信号通路的关键因子。以上研究表明,无论是抑制miRNA-223的表达还是使其过表达,都可能对破骨细胞的形成造成负面影响,因此,适当的miRNA-223表达量对破骨细胞的发生显得尤为重要。

3 展望

骨稳态通过成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收之间的平衡来维持,当破骨细胞骨吸收超过成骨细胞骨形成时,会发生代谢性骨病,例如骨质疏松症。骨质疏松症的治疗通常集中于抑制破骨细胞的过度活化,因此,了解破骨细胞分化和成熟的机制将有助于研发治疗骨质疏松症的新方法。破骨细胞的分化成熟过程受到严格的调控,其中miRNAs是调控因素之一。特异性miRNAs的过表达或抑制能够有效抑制破骨细胞的分化和骨吸收,基于miRNAs的治疗方法为骨质疏松症的治疗提供了新思路。然而,由于此治疗方法尚未成熟,其在投入临床应用之前,仍面临着许多严峻的问题。例如:miRNAs通过靶向哪些特定途径来调控破骨细胞的分化形成？临床上miRNAs对破骨细胞的调节会产生哪些副作用？miRNAs如何在体内有效传递？这些问题都需要在将来得到解答。