洋葱细胞骨架的制作技术研究*

曹小汉 任莉萍 舒 玉 张金波

（阜阳师范学院生物与食品工程学院 安徽阜阳 236037）

细胞骨架的制备及观察是细胞生物学实验教学中的重要实验项目。 细胞骨架是真核细胞胞质中存在的蛋白纤维网络结构， 包括微丝（microfilament，MF）、微管（microtubule，MT）和中间丝（intermediate filament，IF）3 种结构组分［1］。 研究表明，细胞骨架除了保持细胞形状、分隔固定细胞内部结构和参与构成某些细胞器外，还具有物质运输、信号传递、参与细胞运动、分化、增殖，以及调节基因表达等作用［2-3］。由于细胞骨架在细胞生命周期中的重要作用及其与生命活动的密切联系，细胞骨架的研究已成为细胞生物学乃至生命科学、医学等诸多领域的研究热点［4］。在本科生的细胞生物学实验教学中，细胞骨架的制备及显微观察通常是必开实验。 以动物离体的成纤维或上皮细胞作为细胞骨架制备的常用材料，不仅对细胞培养、保存设备及试剂要求较高，且实验周期较长［5］。而植物细胞骨架制备取材方便，对实验仪器设备要求不高， 操作简单且周期短，是细胞骨架制备及观察的实用材料。 以新鲜的洋葱鳞茎为实验材料， 用适当浓度的去垢剂TritonX-100处理细胞，可溶解膜脂，并与大部分非骨架蛋白疏水区结合而将其溶解，剩下的纤维状细胞骨架蛋白比较稳定而不被溶解，经戊二醛固定和蛋白质染料考马斯亮蓝R250 染色后， 可在光学显微镜下观察到网状的细胞骨架结构。

由于实验过程中的相关步骤对于实验结果都非常重要， 例如实验材料洋葱的新鲜程度、TritonX-100 的处理时间、 戊二醛固定时间、 考马斯亮蓝R250 的染色时间等，所以学生在实验过程中很难全面掌握每个环节的要领，因此，不易获得质量较高的细胞骨架装片， 从而影响观察效果。 笔者经长期摸索，总结了完整且成熟的洋葱细胞骨架的制备技术。

1 材料与方法

1.1 材料 新鲜的洋葱鳞茎。

1.2 方法

1）采样。 用镊子撕取洋葱鳞茎内侧的表皮若干片，每片约1 cm2大小，置于加入6 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH=6.8）的注射器中（规格为25 mL），抽真空促使其下沉。

2）TritonX-100 处理。 将下沉的洋葱鳞茎表皮转移至加入2 mL 1% TritonX-100 的烧杯中 （规格为50 mL）处理15 min；除去TritonX-100，用M缓冲液洗3 次，每次5 min。

3）固定。 用3%戊二醛固定30 min；除去固定剂，用磷酸盐缓冲液轻轻清洗3 次，每次5 min。

4)染色。用0.2%考马斯亮蓝R250 染色30 min。

5）制片、镜检。 用蒸馏水轻轻冲洗2 次，然后将样品置于载玻片上，加盖玻片，在普通光学显微镜下观察。

2 结果与分析

1）选择洋葱时，用手轻轻按压洋葱，选择包卷度紧密、紧实度较高的个体，这样的材料较为新鲜。

2）用TritonX-100 处理细胞，抽提15 min 效果较为理想。若处理时间太短，没有抽提掉无关蛋白和脂质，则细胞呈很深的背景颜色，看不清细胞骨架的纤维网络；若处理时间过长，则会破坏细胞骨架，使纤维网络断裂，影响细胞骨架观察。

3）考马斯亮蓝R250 染色30 min 效果较好。 若染色时间较短， 则洋葱鳞茎内表皮细胞骨架大部分尚未染上色（图1A，本文附图见封四）；染色30 min，高倍镜下可观察到细胞骨架纤细、连贯性好且可见其广泛分布于细胞内，染色效果最佳（见图1B）；若染色时间过长，则细胞背景总体着色较深，难以观察细胞骨架（图1C）。

3 结语

细胞骨架的制备及观察是细胞生物学实验教学中较经典且重要的一个实验。 多年实验教学经验表明，按照实验教材常用方法进行实验，往往实验效果不太理想， 实验结果不清晰容易导致学生对细胞骨架相关理论知识的理解不够深入。此外，由于本科生基础实验课的课时较为固定， 要求学生在一次实验课（约3 学时）完成一个相对独立完整的实验内容。 因此，通过对洋葱新鲜程度、TritonX-100 的处理时间、 考马斯亮蓝R250 的染色时间等实验环节进行优化， 确保大部分学生能在既定时间内圆满完成实验。本实验经多次摸索，取新鲜坚实的洋葱撕取内表皮， 用1%TritonX-100处理细胞，抽提15 min，0.2%考马斯亮蓝R250 染色30 min， 可快速有效地制备洋葱细胞骨架，不仅提高了实验教学质量， 而且为学生将来独立从事相关科学研究奠定了基础。