奶粉中蛋白质含量的快速测定

汪菊，付大友，徐晨曦（四川理工学院材料与化学工程学院，四川自贡643000）

奶粉中蛋白质含量的快速测定

汪菊，付大友，徐晨曦
（四川理工学院材料与化学工程学院，四川自贡643000）

摘要：从奶粉中蛋白质的快速检测方法入手，选取了分光光度法中的考马斯亮蓝G-250来进行研究。结果表明，在酸性介质中，蛋白质与考马斯亮蓝G-250溶液反应生成蓝色络合物。该络合物最大吸收波长为594 nm，摩尔吸光系数为3.75×10-5L/（mol·cm），精密度（RSD）为0.55%，相关系数为0.999 3，加标回收率为97.8%。

关键词：蛋白质；考马斯亮蓝G-250；分光光度法

奶粉中含有丰富的蛋白质，是人们日常生活中补充蛋白含量不可缺少的来源，并且它的水分含量低，使得比其他奶制品具有更好地运输和储存能力[1]。但近几年奶粉安全事件时有发生，一些不法商贩为了谋利，常向奶粉中添加一些含氮量高的非蛋白质物质来提高蛋白质含量，这些物质极有可能会对人体造成伤害，如三聚氰胺等。因此，快速、准确地测定奶粉中蛋白质的含量至关重要[2]。目前，对奶粉中蛋白质含量测定的方法已有很多种方法。凯氏定氮法是测量蛋白质含量的经典方法，但此方法步骤繁琐，耗时耗力。本试验是采用紫外分光光度法测定奶粉中蛋白质含量，采用考马斯亮蓝G-250作为显色剂，考马斯亮蓝法是利用蛋白质-染料结合的原理进行染色，定量的测定蛋白质浓度[3]。此法操作简单，快速，灵敏度较高，可以得到满意的结果。

1　试验原理

1976年，Bradfo rd等建立一种测定蛋白质的考马斯亮蓝法（Bradford法），它是根据考马斯亮蓝G-250染料所含的疏水基团在酸性条件下与蛋白质的碱性氨基酸特别是精氨酸及芳香族氨基酸残基通过疏水作用结合形成蓝色蛋白质染料复合物[4]，使染料最大吸收峰的位置（Kmax）由465 nm变为595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色的原理设计的[5]。波长在595 nm条件下，所测定吸光度与蛋白质浓度成正比。

2　材料与方法

2.1材料与仪器

2.1.1仪器

UV-2000紫外可见分光光度计：龙尼柯（上海）仪器有限公司；AR1140分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；石英比色皿、比色管及容量瓶等玻璃仪器。

2.1.2材料

2.1.2.190%乙醇溶液

移取90 mL无水乙醇于100 mL容量瓶中，定容至刻度。

2.1.2.2考马斯亮蓝G-250溶液（0.1 mg/mL）

称取0.100 0 g考马斯亮蓝G-250于100 mL烧杯中，用50 mL 90%乙醇溶解，转入至1 000 mL容量瓶中，在此容量瓶中加入100 mL 85%磷酸，用水定容至刻度，该溶液在常温下可放置1个月。

2.1.2.3牛血清蛋白溶液（100 μg/mL）

称取0.010 0 g牛血清蛋白于100 mL烧杯中，溶解，转入至100 mL容量瓶中，定容至刻度。

2.2方法

2.2.1牛血清蛋白的标准曲线

分别移取 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 100 μg/mL牛血清蛋白溶液于6支比色管中，补水至1.00 mL，5.00 mL 0.1 mg/mL考马斯亮蓝G-250溶液，加入1.50 mL 85%磷酸溶液，摇匀，然后在波长为594 nm下进行测定。此时注意溶液必须在6 min内测定完。

2.2.2样品测定

称取0.010 0 g奶粉于100 mL烧杯中，溶解，转入至100 mL容量瓶中，定容至刻度，作为待测液。然后移取1.00 mL待测液于25 mL比色管中，然后按2.2.1步骤进行。

3　结果与分析

3.1磷酸最佳量

移取0.40 mL牛血清蛋白溶液于6支比色管中，补水0.60 mL，5.00 mL考马斯亮蓝G-250溶液，再分别加入0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL 85%磷酸溶液，然后按2.2.1步骤进行，结果见图1。

图1　磷酸最佳量Fig.1　The optimal amount of phosphate

由图1可知，加入1.5 mL 85%磷酸，吸光度达到最大，此时磷酸用量最佳。这是由于磷酸用量太少，溶液显色效果不明显，但是磷酸加入量过多，使得溶液颜色过深而影响测量，导致吸光度偏小。

3.2考马斯亮蓝G-250最佳量

移取0.40 mL牛血清蛋白溶液于6支比色管中，补水0.60 mL，分别加入2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、8.00 mL考马斯亮蓝G-250溶液，然后按2.2.1步骤进行，结果见图2。

图2　考马斯亮蓝G-250最佳量Fig.2　The optimal amount of Bradford G-250

图2表明，当加入4.00 mL～6.00 mL显色剂考马斯亮蓝G-250时，吸光度达到稳定。说明此时考马斯亮蓝G-250与牛血清蛋白所形成的复合物达到稳定状态，因此考马斯亮蓝G-250的最佳用量为5.00 mL。

3.3最佳显色时间

移取0.40 mL牛血清蛋白溶液于比色管中，然后按2.2.1步骤进行，分别反应2、4、6、10、15、20 min后，测定，结果见图3。

图3　最佳显色时间Fig.3　The optimal amount of chromogenic time

根据图3显示，显色时间在2 min～6 min时，吸光度达到最稳定。说明时间对其所形成的复合物有一定性的影响，因此溶液必需在6 min中内测定。

3.4牛血清蛋白的标准曲线

图4是以牛血清蛋白含量为横坐标，所测吸光度为纵坐标，在波长λ=594 nm下所得到的标准曲线，其方程为：y=0.004 5x+0.006 1，R2=0.999 3。

3.5精密度及回收率

精密度及回收率见表1。

图4　牛血清蛋白的标准曲线Fig.4　Standard curve of bovine serum albumin

表1　精密度及回收率Table 1　The precision and recovery

由表1可以看出，测定结果的相对标准偏差为RSD=0.55%。从此方法测定结果的均值和RSD值来看，该法的重现性好，精密度理想。并且此方法平均回收率达标，表明此法可行。

3.6样品测定

样品测定结果见表2。

表2　奶粉测定结果Table 2　The results determined by formula

由表2可知，B奶粉中的蛋白质含量比A奶粉高7.08%，两种奶粉中蛋白质含量相差不大。并且两种奶粉的测定结果与实际所买奶粉蛋白质含量最大相差0.14%，在误差允许范围内，因此测定结果基本符合要求。

4　结论

考马斯亮蓝法由于灵敏度高、测定快速简便、干扰物质少等优点，得到广泛应用。此方法除测定奶粉等牛乳中蛋白质含量外，还可以推广到其他乳制品及食品等中蛋白质含量测定，但此法中蛋白质与显色剂所形成的络合物稳定时间太短，需要进一步研究解决。

参考文献：

[1]McGoverin C M,Clark A S S,Holroy S E,et al.Raman spectroscopic quantification of milk powder constituents[J].Analytica Chimica Acta,2010,673:26-32

[2]马丽华,田雨,姜瞻梅,等.双缩脲法检测奶粉中总蛋白质快速检测试纸的研制[J].食品工业科技,2012,33(11):327-329

[3]董娜,贾艳菊,张晓,等.考马斯亮蓝法测定奶粉真蛋白的研究[J].食品安全与检测,2011,36(11):272-274

[4]宋思远,李巧玲,刘英华,等.乳及乳制品中蛋白质检测技术的研究进展[J].江苏农业科学,2012,40(5):279-282

[5]许家喜.蛋白质的检测方法与乳制品中蛋白含量测定[J].大学化学,2009,24(1):67

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.036

收稿日期：2014-01-14

基金项目：四川省教育厅重点项目（13ZA0123）

作者简介：汪菊（1989—），女（汉），在读硕士研究生，研究方向：工业分析。

Study on the Fast Determination Method of Protein Content in Milk Power

WANG Ju，FU Da-you，XU Chen-xi
（College of Materials Chemical Engineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China）

Abstract：The rapid determination method of protein was studied.A Bradford G-250 method among spectrophotometric colorimetry was chosen to determine protein content in milk powder.The results showed that the maximum absorption wavelength of protein and Bradford G-250 red-brown generating blue complex was 594 nm in the acidic medium and the apparent molar absorptive was 3.75×10-5L/（mol·cm），the precision （RSD）was 0.55%，the relevant coefficient was 0.999 3，the recovery of standard addition was 97.8%.

Key words：protein；Bradford G-250；spectrophotometry