一株沙雷氏菌的分离鉴定及其对德国小蠊的毒力测定*

刘九榕 邵博文 周宇石 刘慧敏 阚 硕 薄鹏飞 张 凡**

（1 东营市第一中学 山东东营 257091 2 山东师范大学生命科学学院 山东济南 250014）

德国小蠊（Blattella germanica）是常见的世界性室内卫生害虫之一，能携带多种病原微生物，其死亡虫体和分泌物还是引发人类哮喘、 鼻炎的重要过敏原［1-2］。 目前，德国小蠊的防治仍以化学防治为主，但化学杀虫剂存在危害人体健康、环境污染和抗药性频发等诸多问题，相比于化学防治，生物防治发展前景更为广阔， 研究和开发新型德国小蠊生防制剂迫在眉睫。

粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阴性菌， 在害虫防治方面具有极大潜力，现已广泛应用于鳞翅目、直翅目、同翅目和鞘翅目昆虫的防治中［3-6］。 冯书亮等［7］分离得到的粘质沙雷氏菌HBZBS21 菌株对黄胫小车蝗（Oedaleus infernalis）有很高的杀虫毒力，6.2×106CFU/mL 浓度菌悬液4 d 杀灭率可达80%以上。 粘质沙雷氏菌能有效地控制昆虫种群数量增长，ps-1 菌株处理过的甜菜夜蛾存活率和产卵率明显低于对照组， 种群的增长比对照降低了74.4%～100%［8］。

本研究自中华真地鳖虫尸上分离得到一株粘质沙雷氏菌， 并进一步评估了该菌株对各龄期德国小蠊的杀虫效果， 为研究开发新型德国小蠊生防制剂奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

生物材料： 德国小蠊均来自山东师范大学动物抗性重点实验室，未接触任何化学和生物药物，遗传背景单一；饲养环境：温度（28±2）℃，相对湿度（60±5）%，光照时间为12 L∶12 D，采用小鼠全价饲料饲喂，饮水为自来水；粘质沙雷氏菌（EB0732）分离自患病死亡的中华真地鳖（Eupolyphaga sinensis Walker）虫尸，现保藏于山东师范大学动物抗性重点实验室。

试剂： 细菌基因组DNA 提取试剂盒（Tiangen公司）；生化反应管（青岛海博生物技术有限公司）。

仪器： MLR-351H 型昆虫培养箱（日本三洋公司）；YXQ-LS-50S11 型高压灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；MyGeneTM 系列精品型PCR 仪（杭州朗基科学仪器有限公司）；Hitachi冷场发射扫描电镜Regulus8100（天美中国科学仪器有限公司）。

1.2 形态观察

菌落形态观察： 将分离的菌株接种到LB 培养基上，28℃培养24 h 后观察生长情况及菌落特征。

细胞显微形态观察：扫描电镜标本采用临界点干燥标本，制备方法参照林加涵等［9］。 采用Hitachi RS8100 扫描电镜在1.0 kV 加速电压下观察。

1.3 菌株理化性质测定 将分离的菌株接种至LB培养基上，28℃培养24 h 后， 接种至单个生化反应管，生理生化实验结果参照《伯杰氏细菌鉴定手册》进行比对。

1.4 菌株16S rDNA 序列测定及系统发育树构建

将供试菌株接种至LB 培养基上，28℃培养24 h后， 参照细菌基因组DNA 提取试剂盒步骤提取DNA。 使用细菌16S rDNA 通用引物（1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′；27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）进行PCR 扩增。 随后进行琼脂糖凝胶电泳，产物回收委托华大基因公司测序。运用ClustalW 对所测得的16S rDNA 序列与从GenBank 中通过BLAST 检索获得的参考序列进行多重对位排比，MEGA5.0 分析对比结果，运用N-J Tree 方法构建系统发育树。

1.5 菌株毒力测定 选取德国小蠊1～3 龄若虫，4～5 龄若虫，6～7 龄雌、雄若虫和雌、雄成虫各60 只，每组20 只试虫，设置3 个平行实验组，饥饿24 h 供试。 配制5 个浓度（1×105CFU／mL、1×106CFU／mL、1×107CFU／mL、1×108CFU／mL、1×109CFU／mL）的EB0732 菌悬液。 实验组饲喂2 μL 菌悬液，对照组饲喂2 μL 无菌水，记录20 d 累计死亡率。

2 结果与分析

2.1 形态观察 EB0732 菌株在LB 培养基上培养24 h 后，菌落呈紫红色，光滑、湿润，表面呈金属光泽，边缘整齐或不整齐，有轻微异味（图1A）。镜检结果可以看出菌体两端钝圆，杆状，无芽孢，边缘整齐光滑，长0.81～1.56 μm，直径0.48～0.69 μm（图1B）。

德国小蠊感染后表现为行动迟缓， 少食甚至不食，粪便呈现红色。 虫体死亡后呈暗红色，逐渐变软、变成红色或发黑，伸直或皱缩，虫体破坏后有红色菌脓流出，分离到大量EB0732 菌株，证实德国小蠊因EB0732 菌株感染致死， 正常虫体与死亡虫体对比见图1C。

图1 EB0732 菌体的形态及德国小蠊正常与死亡虫体对比

2.2 菌株鉴定 根据菌体形态特征、部分生理生化特征（表1）参考伯杰氏手册，将EB0732 初步鉴定为沙雷氏菌属。

表1 EB0732 菌株生理生化指标

EB0732 菌株的16S rDNA 序列PCR 扩增片段为1 230 bp，选取质量较高的700 bp 片段进行系统发育树构建， 该片段在GenBank 中的登录号为MH780739。 根据序列同源性比对结果，在NCBI 中选取6 个同源性较高的模式菌， 选取肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae R6）作为外类群构建系统发育树。结果表明EB0732 与粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens N2、Serratia marcescens VGH107 和Serratia marcescens LCT-SM166） 形成一个簇群，同源性为100。 结合生理生化指标，将EB0732 菌株鉴定为粘质沙雷氏菌（图2）。

图2 基于16S rDNA 序列粘质沙雷氏菌EB0732 的系统发育树（N-J Tree）

2.3 菌株的毒力测定 试毒实验结果显示该菌株毒力较强，菌悬液浓度与德国小蠊的死亡率成正相关，虫龄与死亡率呈负相关，但该菌株对雌、雄虫的毒力不存在显著差异（具体结果可见表2，P＞0.05）。

3 讨论

EB0732 菌株侵染德国小蠊后，虫体呈现相似症状， 死亡虫体中可再次分离获得该菌株， 证实EB0732 为德国小蠊致病菌株，是潜在的生防菌。

生理生化指标结果常存在偏差， 但运用16S rDNA 序列同源性分析的方法能准确地将未知菌鉴定到种水平，弥补传统方法的不足。本研究通过生理生化实验结合16S rDNA 序列同源性分析，将病原菌株EB0732 鉴定为肠杆菌科， 沙雷氏菌属的粘质沙雷氏菌。据报道，粘质沙雷氏菌对棉铃虫、 菜青虫和甜菜夜蛾等常见鳞翅目害虫有较强致病力，田间喷洒菌液24 h 后，昆虫会出现不同程度的行动迟缓，停食和虫口明显减退等现象［10］，但该菌在蜚蠊目中的应用尚未有报道，本实验首次自中华真地鳖虫尸分离出该菌，并评估了它对德国小蠊的杀灭效果，为德国小蠊的防治提供了新思路。

表2 粘质沙雷氏菌EB0732 菌株20 d 累积死亡率（%）

毒力测定显示EB0732 菌株对德国小蠊有较强毒力，1×109CFU/mL 的EB0732 菌株作用于1～3龄德国小蠊若虫时，20 d 累计杀灭率达87.50%。该菌株对于不同虫龄的德国小蠊毒力差异显著，死亡率随虫龄增长递减。一方面，这可能与若虫存在蜕皮期有关，在宿主昆虫若虫蜕皮期，肠管壁较薄弱，昆虫病原菌更易侵入昆虫血腔，引起昆虫患败血症死亡；另一方面，不同发育阶段虽具有相似的免疫基因组成， 但虫龄小的昆虫免疫基因的表达不完善，如微粒体多功能氧化酶（MFO）、细胞色素P450 氧化酶、乙酰胆碱酯酶和酚氧化酶等解毒酶的选择性表达［11-12］，这暗示了该菌株用以防治德国小蠊的最佳时期为若虫期。 此外，总体来看，该菌株对雌、雄虫的毒力没有显著性差异，但雄性略高于雌性，这可能与雌性体重更大，免疫防御机制更完善有关［12-13］。

粘质沙雷氏菌可通过产生几丁质酶、 磷脂酶、灵菌红素等次级代谢产物，水解昆虫幼虫体表和围食膜结构，导致肠道微绒毛变形甚至脱落，影响昆虫肠道对病原微生物的抵御和营养摄取等正常生命活动［14-16］。经初步试验发现，该沙雷氏菌株单剂毒力相对较弱， 下一步可采用该菌株与化学杀虫剂、病原真菌等科学复配以增强其生防效果。 各组分杀虫机理和作用方式均不相同， 可从破坏虫体免疫、神经系统以及营养消耗等多方面产生协同效应，从而加速虫体的死亡，产生更好的杀灭效果。