NAA、6-BA 和KT 对烟草叶片不定芽和不定根分化的影响

张凌云 孙 娟 刘艳秋

（首都师范大学附属回龙观育新学校 北京 102208）

烟草（Nicotiana tabacum L.）是我国重要的经济作物之一，在医药、农业病虫害防治和保健等方面具有重要的应用价值［1-2］。 此外，烟草常被作为植物基因工程和分子生物学研究中重要的模式植物。 通过对烟草的遗传转化探究基因的功能及作用机理［3-4］，解析次生代谢产物的合成机制［5］等，其中烟草组织培养技术是上述研究的关键环节。 有关萘乙酸（NAA）和6-苄基氨基嘌呤（6-BA）诱导不同种植物组织分化出根和芽的研究较多［6-8］，而不同浓度的NAA、6-BA 和激动素（KT）对烟草离体叶片不定器官分化的研究较少。 詹虹等［9］研究发现，MS 培养基中添加0.5 mg／L NAA 和0.5 mg／L 6-BA， 烟草叶片的出芽率为100%；MS 培养基中添加1.0 mg／L NAA 和0.1 mg／L 6-BA， 叶片的出芽率为0。 李玉明等［10］研究发现，NAA 和6-BA浓度比为5∶1 时，可诱导烟草叶片生成不定根；两者的浓度比为1∶5 时，可诱导叶片生成不定芽。 本实验以普通烟草品种Wisconsin 38 为实验材料，通过设计不同浓度、 不同比例的NAA、6-BA 和KT，研究它们对烟草离体叶片不定器官分化的影响，并筛选获得适宜不定芽和不定根分化的培养基。研究结果为烟草的组织培养及烟草基因工程提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料 普通烟草品种Wisconsin 38（W38）的种子由中国农业大学农学院特用作物研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 烟草无菌苗的获得 将普通烟草品种W38 的种子用2%次氯酸钠表面消毒5 min，无菌水漂洗2～3 次后，接种于MS 培养基中培养。培养条件为（25±2）℃，每日16 h、2 200 lx 光照。

1.2.2 培养基的设计及配制 以MS 为基本培养基，不同培养基的组成见表1，所有培养基中均添加30%蔗糖和0.8%的琼脂。

表1 不同培养基的组成

1.2.3 烟草叶片不定芽和不定根的诱导与分化取生长30～40 天无菌烟草植株中上部的叶片，去除主脉和叶缘，切成1 cm2大小的叶盘，接种于不同组合的培养基（表1）中，在（25±2）℃，每日16 h、2 200 lx 光照条件下培养。每个处理为30 个外植体，2 次重复实验。每周观察、照相记录。培养5 周后，统计出芽率和生根率。 根据2 次重复实验的统计结果，计算平均出芽率和生根率。

2 结果与分析

2.1 烟草叶片不定芽分化适宜培养基的获得烟草叶片接种培养于1～12 号培养基中， 叶片切口处均能形成愈伤组织（图1、图2）。 培养3 周后，叶片在1～5 号培养基上形成不定芽，其中1 号最多，2号次之，6～12 号培养基中的叶片没有不定芽的形 成。 3～5 周 后，1 号、2 号、4 号 和5 号 培 养 基中的叶片全部有不定芽的形成， 其中1 号和2 号中每个叶片平均出芽数均大于15 个芽，2 号培养基中不定芽生长迅速，已形成较大的叶片（图1、图2、表2）。因此，在MS 培养基中添加0.1 mg／L NAA 和0.25 mg／L 6-BA 的2 号培养基为适宜烟草离体叶片不定芽分化的培养基。

2.2 烟草叶片不定根分化适宜培养基的获得由图1 和图2 可以看出，培养3 周后，3 号、6 号、9 号、11 号和12 号培养基中的叶片有不定根的形成，其中12 号最多，11 号次之，其他培养基中的叶片没有不定根的形成。 3～5 周后，9 号、11 号和12 号培养基中的叶片全部有不定根的形成， 其中12 号培养基中每个叶片的出根数最多，9 号次之（图1、图2、表2）。 因此，12 号培养基为烟草离体叶片不定根分化适宜的培养基，即在MS 培养基中添加1.0 mg／L NAA 和0.1 mg／L KT。

2.3 不同浓度NAA、6-BA 和KT 对烟草叶片不定器官分化的影响 在含有0.1 mg／L NAA 的1～6 号培养基中， 烟草离体叶片出芽率普遍高于其他培养基（表2）。 其中，6-BA 或KT 与NAA 浓度的比值为10∶1 和5∶2 时，出芽率均为100%。 随着6-BA 或KT 浓度的降低，出芽率降低，而生根率增加。其中，离体叶片在添加0.1 mg／L KT 培养基（6 号）中的出芽率显著低于在添加相应浓度6-BA 培养基（3 号）中的出芽率。 由此可知，6-BA比KT 更易于诱导叶片不定芽。

在含有1.0 mg／L NAA 的7～12 号培养基中，离体叶片生根率普遍高于其他培养基（表2）。 其中，6-BA 或KT 与NAA 浓度的比值为1∶10 时，生根率均为100%， 随着6-BA 或KT 浓度的升高，生根率降低，而出芽率增加。 其中，离体叶片在添加1.0 mg／L 6-BA 培养基（7 号）中的生根率为0，显著低于在添加相应浓度KT 培养基（10 号）中的生根率。结果显示，较高浓度的6-BA 能影响不定根的分化。

图1 烟草叶片在添加0.1 mg／L NAA 和不同浓度6-BA 或KT 的MS 培养基中的分化情况

图2 烟草叶片在添加1.0 mg／L NAA 和不同浓度6-BA 或KT 的MS 培养基中的分化情况

3 讨论

激素是植物组织培养中器官分化的关键因素。 生长素常用于诱导愈伤组织的形成和根的分化，细胞分裂素的主要生理作用是促进细胞分裂、诱导芽的形成、促进芽的生长［11］。 本实验结果显示，6-BA 或KT 与NAA 浓度的比值为10∶1 和5∶2时，出芽率均为100%。 6-BA 或KT 与NAA 浓度的比值为1∶10 时， 生根率均为100%。 低浓度的NAA 与较高浓度的6-BA 或KT 组合可促进烟草离体叶片不定芽的分化，较高浓度的NAA 与低浓度的6-BA 或KT 组合可促进根的形成，这与前人［10］的结果一致。 进一步分析发现，当NAA 浓度一定时，培养基中添加6-BA 比KT 更易于诱导烟草叶片分化不定芽。

研究还发现， 虽然3 号、6 号、7 号和10 号培养基的NAA 与6-BA 或KT 的浓度比均为1∶1，但是它们的离体叶片出芽率和生根率却不同。 3 号与7 号培养基相比，NAA 和6-BA 的浓度分别由0.1 mg／L 增加到1.0 mg／L，出芽率和生根率分别为78.34%和95%，68.34%和0。 结果显示， 随着NAA 和6-BA 浓度的增加， 离体叶片不定根的分化被强烈的抑制。 6 号和10 号中， 随着NAA 与KT 浓度的增加，出芽率和生根率也随之升高。 因此，NAA、6-BA 和KT 的浓度是烟草离体叶片不定器官分化的影响因素。 本实验与前人［9］的研究结果不尽相同，可能是由于烟草品种不同、选取的叶片外植体生理状态不同等因素， 使得离体培养的叶片对生长调节剂的敏感性不同， 从而影响不定器官的分化。

表2 不同生长调节剂对烟草离体叶片不定芽和不定根的影响

致谢： 本研究的实验内容在中国农业大学农学院特用作物研究中心完成，在此致谢！