CAR-NK在肿瘤免疫治疗方面的研究进展

李欣阳

（陕西师范大学，陕西西安 710100）

嵌 合 抗 原 受 体（Chimeric antigen receptor，CAR）T细胞已经在血液肿瘤的临床治疗上获得了广泛认可，2017年7月，Tisagenlecleucel被美国FDA认证可用于儿童和成人（3～25岁）的R/R B-ALL患者的治疗，但CAR-T引发D的同种异体T细胞引起的移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD），使得CAR-T在制备上只能用患者自体T细胞。自然杀伤细胞（Nature killer cell，NK）能以自发的方式杀死靶细胞，无主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC）限制性，因此 CARNK在肿瘤免疫治疗领域受到了更广泛的关注。

1 NK细胞

NK细胞由造血干细胞分化发育而来，在限制肿瘤转移方面尤为重要。常用的人NK细胞表型标志是 CD56+、CD16+、CD19-、CD3-，既不表达 T细胞的表型，又不表达B细胞的表型。根据NK细胞表达CD56分子表面密度，可将其分为CD56bright和CD56dim两个亚群，CD56dimNK细胞亚群以杀伤功能为主，可介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 作 用（Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity，ADCC）。CD56brightNK细胞亚群以分泌细胞因子为主，且CD56dimNK细胞亚群比CD56brightNK细胞亚群更具天然细胞毒性。

NK细胞表面具有两类受体。第一类受体可以激活NK细胞的杀伤作用，称为激活性受体，包括NKG2D、NCR等；第二类受体可以抑制NK细胞的杀伤作用，被称为抑制性受体，包括杀伤细胞免疫球蛋白 样 受 体（Killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR）和NKG2家族（NKG2A、B、C和E/CD94）。主流观点认为，NK细胞是通过活化和抑制受体信号之间的平衡来区分正常的健康细胞和敏感靶细胞，最终决定NK效应功能。

活化的NK细胞主要通过4种途径发挥细胞毒作用。第一种途径是穿孔素/颗粒酶途径，通过细胞膜渗透性的增加引起靶细胞裂解。第二种途径是Fas/FasL途径。Fas向细胞传递“死亡信号”，与FasL结合，使靶细胞凋亡。第三种途径是细胞因子途径，激活目标细胞核酸内切酶，降解基因组DNA。第四种途径是表达IgGFc受体，通过ADCC效应杀伤靶细胞。因此，NK细胞是临床肿瘤免疫治疗中极具潜力的淋巴细胞。

2 CAR-NK细胞

CAR-NK具有CAR-T的基本框架，包括细胞外抗原识别部分、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。细胞外结构域是抗原识别位点，跨膜结构域是细胞内信号传导组分的连接，细胞内信号传导结构域衍生于 T 细胞受体（T cell receptor，TCR）/CD3。CAR-NK通常使用CD3ζ作为第一信号基序，加入共刺激分子基序，如CD28/CD137或CD28-CD137，以形成细胞内信号区域。

2.1 抗原识别区

抗原识别区通常由衍生自单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAb）的重链和轻链的可变区片段（Single chain variable fragment，scFv）组成，通过柔性接头融合在一起，无需抗原递呈细胞的参与，即可将免疫细胞定向到肿瘤相关抗原（Tumor- associated antigen，TAA）。迄今为止研究的大多数scFv是鼠源的，会在人体内引起细胞介导的排斥或者致敏反应，或者引起人抗小鼠抗体（Human anti-mouse antibody，HAMA）或抗独特型免疫应答，所以，许多研究人员正在探索人类化scFv以规避HAMA的发生，如抗人类表皮生长因子受体 2（Human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的FRP5抗体等[1]。

为了提高CAR-NK特异性识别肿瘤的能力，可将NK细胞表面活化型受体的配体放在细胞外结构域的设计中，如NKG2D。NKG2D是在大多数CD8+T细胞和NK细胞上表达的关键活化受体，与死亡相关 蛋白 10（death-associated protein 10，DAP10）或DAP12转移蛋白结合，提供不同的激活信号，这两种信号均可激活NK细胞的细胞毒性。

2.2 细胞内信号传导区

跨膜区一般被认为对CAR-NK细胞的整体结构和功能都没有太大的影响。目前CAR-NK已经运用了多种跨膜区，如CD3ζ/CD8的跨膜序列等。CARNK活化信号的强弱是由胞内信号区的结构决定的，其所含的ITAM会在胞外受体与其配体相互作用被酪氨酸激酶磷酸化，从而招募Syk或者ZAP70，进而对下游蛋白磷酸化传递信号，CD3ζ是CAR结构的经典细胞内信号区段，CAR结构中含有单一ITAM的DAP12和含有3个ITAM的CD3ζ具有相同的活化下游信号的能力。

3 CAR-NK细胞用于抗肿瘤治疗

近年来，CAR-T在多种血液肿瘤临床治疗取得了成果，但也存在如细胞因子风暴、GVHD等负面效应。NK细胞同种异体反应具有提高异基因造血干细胞移植治疗的潜力，因此NK细胞被用于肿瘤免疫治疗。CAR-NK的目标是建立新的激活途径以增强细胞的抗肿瘤作用并改善肿瘤细胞靶向，它能够对多种恶性肿瘤表现出较强的细胞毒性[2]。

大量临床前研究已经测试了CAR-NK细胞对血液系统恶性肿瘤的各种靶抗原的疗效，如CD19、CD20、CD138等。Shimasaki N等[3]在白血病小鼠模型中测试人NK细胞中含有CD3ζ和4-1BB信号传导分子受体的表达，结果表明表达抗CD19-BB-ζ的NK细胞在体外对CD19阳性靶细胞具有高度细胞毒性，并分泌高水平的干扰素（IFN）-γ，在B细胞白血病的异种移植模型中发挥了相当大的细胞毒性。Chu Y等[4]在研究中发现，多次注射抗CD20 CAR修饰的exPBNK也延长了B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-cellnon-Hodgkinlymphoma，B-NHL）肿瘤 -异种移植物的存活，抑制肿瘤细胞的迁移。

除治疗血液肿瘤外，CAR-NK在实体瘤方面也 有 不 错 效 果 ，包 括 HER-2 / Erb-2 等 靶 抗 原。Schönfeld K 等[5]将已建立的人 NK-92 细胞重定向至肿瘤相关的 ErbB2（即 humanepidermalgrowth factor receptor-2，HER2）抗原，构建携带CD28和CD3ζ信号传导结构域的ErbB2特异性抗体FRP5（CAR5.28.z），产生表达人源化CAR的稳定克隆细胞系，结果显示NK-92 / 5.28.z细胞在体外能有效裂解表达ErbB2的肿瘤细胞，显示出连续的靶细胞杀伤作用。Liu等[6]人通过荧光激活细胞分选（FACS）在细胞表面上表达高水平融合蛋白的转导的NK-92-抗erbB2 scFv-CD28-ζ细胞后，发现这些细胞特异性地增强了表达erbB2的人乳腺癌细胞系MDA-MB-453和SKBr3的细胞死亡。CAR-NK在实体瘤方面的发展以使其成为肿瘤免疫的新起之秀。

4 CAR-NK细胞的优势与发展

最近加利福尼亚大学圣地亚哥分校[7]设计了9种靶向间皮素的CAR构建体进行体外杀伤实验，并在小鼠模型中比较CAR-NK和CAR-T细胞的作用。结果显示，CAR-NK细胞具有更小的毒性，比CAR-T细胞更安全。其次，同种异体NK细胞不会引发GVHD，并降低长期存在产生的毒副作用；此外，CAR-NK细胞保留了通过自身天然受体识别和靶向肿瘤细胞的内在能力。因此，与CAR-T细胞相比，即使理论上肿瘤细胞下调CAR靶抗原，它们也不太可能逃避NK细胞的免疫监视，同种异体NK细胞为免疫疗法提供了应用潜力。

如何改造NK细胞才能表现出最佳效果，仍是未来CAR-NK研究领域的主要问题。CAR-NK作为一种新型的治疗肿瘤的免疫方法，和其他抗肿瘤技术进行联合运用为一些肿瘤患者带来了希望，即使它存在不足但潜力巨大，希望之后的研究能够使CAR-NK不断的完善发展。