生物物证DNA污染的成因与预防

张飞，黎波

（新疆警察学院，新疆乌鲁木齐 830000）

生物物证作为证据物证的一种，主要包括人源性生物物证和非人源性生物物证[1]。人源性物证主要包括骨片、毛发、组织块、血痕等组织器官，精液（精斑）、唾液（唾液斑）、粪便、尿、羊水、呕吐物等分泌物和排泄物，此外还有指纹、唇纹、咬痕、足迹（赤足）等。非人源性生物物证主要有动物、植物、昆虫和微生物等物证，如某些动物的血液（痕）、体液（斑），某些植物的液汁或其斑痕及其提取物等，一些可用以推断死后间隔时间和所到区域的昆虫或土壤中含有的包括各种细菌、真菌在内的微生物等群体。

生物物证技术是在传统法医物证检验基础上发展起来的一门新兴学科，广泛应用于刑事、民事案件的侦查检验、鉴定。该学科涉及生物化学、分子生物学、基因工程、法医学、人类学等多门自然学科[2]。因此，生物物证在自然科学技术发展的基础上，在刑事案件中对于人源性生物检材的种属认定起到关键性作用。随着DNA提取技术以及二代测序技术的不断完善，高通量测序在刑事案件人源性生物检材的分析越来越受到重视[3-6]。然而，在实际生物物证DNA的提取和检测过程中经常会发生检材污染的问题，无论是勘查提取人员的污染还是分析检验人员的污染都不可避免，严重影响实验结果。本文针对DNA样品提取分析过程常见的污染进行分析讨论，并提出可行性建议，以期减少检验过程的样品污染。

1 生物物证DNA的污染

造成DNA实验污染的因素主要分为外因和内因，外因主要有:（1）自然形成的污染，主要是生物检材暴露在环境中受到杂物的污染；（2）勘察人员在发现、运输、提取时造成的污染；（3）发生在物证流转过程中导致的污染。内因主要有实验室内使用试剂污染、气溶胶污染、核心设备污染，此类污染发生在物证检验过程中，不易发现。

1.1 环境对生物检材的污染

环境对生物检材的污染是最普遍也是不可避免的，由于勘查人员勘查的是静态的现场，是经过作案人干扰过或作案人处理过的现场，有很多的不确定因素在里面，例如掉在血泊中的烟蒂、带血的手套、水中的衣物、抛弃在垃圾桶中的物证等等，这些生物检材在检测过程中都会受到周围环境的污染和干扰。特别是微生物细胞，或少量的人体脱落细胞等的污染，研究结果显示，至少20个口腔上皮细胞或30个精子细胞检测运用Identifiler plus PCR试剂盒（美国AB公司）检测，可以获得全部分型。因此，越微量的物证越容易被污染。此类污染即使是微生物DNA片段在进行PCR扩增时也会被扩增出来无法去除，导致假阳性结果从而干扰分析。

1.2 生物检材勘查提取过程造成的污染

现场勘察人员徒手提取物证，或使用未经过消毒灭菌的器具提取物证，以及未及时更换一次性手套、剪刀、镊子等情况都容易使样品污染，另外勘察人员使用吸附性较好棉手套提取造成的吸附性污染，现场物证在运输时使用的包装袋混装、包装袋破损泄露、包装袋反复使用，物证袋生产环节出现污染等因素，都可以使检材受到干扰，误导检验结果。

提取过程造成的污染，主要是生物物证在实验室提取检验时，操作人员操作不规范或者环境不达标等。例如物证进入实验室后，检验人员初检不认真，使用不洁器具操作，或者未及时更换PE离心管、移液枪枪头等一次性耗材，未清洗或未按规定更换上样胶垫等，都容易造成样本提取时交叉污染。或者是检测人员在检测过程中不小心将自己的唾液或皮屑混入到检材中，导致“乌龙检材”的出现，也会对检测结果造成影响。

1.3 DNA纯化试剂、气溶胶的污染

试剂在配制分装过程造成的污染，尤其是移液器操作不当，最容易造成污染。特别在PCR扩增中最容易导致污染，因为在PCR扩增过程中，扩增的DNA产量是呈指数上升的，经过n个循环的扩增，一个DNA分子的产量便达到2n个拷贝。PCR产物一般为 1013拷贝 /mL，取 0.1 mL 即为 109拷贝，而 1 mg人基因组DNA才含1.4×106拷贝的单拷贝基因片段。PCR反应具有强大的扩增效率，使得极微量的污染便可导致假阳性结果。

另一种是气溶胶的污染，主要是由固体或液体小质点分散并悬浮在气体介质中形成的胶体，又称气体分散体系。分散相为固体或液体小质点，其大小为10-3～10-7cm，分散介质为气体。气溶胶污染的一般原因是离心管管盖松懈导致泄露，在PCR反应中，有高温、低温的周期性循环，高温时，扩增反应液蒸汽溢出，扩增仪顶盖密封不严，多次扩增不断累积，达到足够浓度时造成污染。此类污染难以清除，难以预测[7]。

1.4 核心设备污染

在提取、纯化、扩增生物检材DNA时，常用的仪器设备有高速冷冻离心机、恒温振荡仪、PCR扩增仪、3030XL遗传学分析仪等设备。不按规定及时清洗，造成DNA产物分子级别堆积，形成设备内部污染。比如，有些检验人员在使用PCR扩增仪时，刚扩增完成就急于打开设备取样，由于PCR扩增仪温度还未降下来，反应体系也处于高温状态下，高温膨胀使管盖蹦出，会形成交叉污染。

2 生物检材DNA污染对检验结果的影响

DNA污染可能导致假阳性的出现，干扰DNA分型图谱的分析，误导侦查人员。DNA污染可能会产生原本没有的DNA信息，也可能会抑制、消除或完全覆盖原有的DNA信息，从而造成严重后果[7]。比如可能在原本没有犯罪嫌疑人DNA样本的检材上检测出他的DNA，错误地刻画犯罪嫌疑人，导致错误的案件定性，错误地推断作案人数、作案人的性别等。这些都会误导侦查方向，延误破案时间。

3 预防生物检材DNA污染的策略

在生物检材DNA降低污染过程中，要做好“人防”和“物防”两方面的工作，“人防”主要指在现场勘查中进行生物检材提取时，勘察人员首先应树立防污染的意识，首先做好自我保护，做到不污染样品的同时也不让样品污染自己，勘查提取前先戴好口罩、帽子、防护服等必要措施，检查勘查提取工具是否洁净，确保样品在源头无污染，尤其是防止外来人源性污染。检材越微量，越应防止外来人源性污染；因为检材越微量，PCR检验对外来人源性污染越敏感。“物防”主要指在实验室检测过程中防止实验试剂、实验室环境、核心设备等对样品的污染。

3.1 遵守行业标准，按程序进行提取与检验

现场勘查人员、检材送检人员、物证鉴定人员在生物检材提取、送检、检验过程中，必须按照中华人民共和国公共安全行业标准《法医学物证检材的提取、保存与送检》（GA/T169—1997）规定的相关内容进行操作。在实验操作过程中严格按照仪器的操作规程进行，实验试剂的使用要符合标准，不可使用过期或污染的试剂。特别是DNA提取过程使用的试剂，比如酶、超纯水、提取液等，都应该进行分装和隔离保管。最应注意的是移液枪枪头的使用，必须是一次性的，按照一种试剂一个枪头、一个样品一个枪头的原则，不可重复使用，交叉使用。

3.2 做好污染监测设置对照

必须要时刻注意污染的监测，监测样品是否受到污染。通过有效的监测，采取正确的相应措施，防止或消除污染。另外对照试验也是监测DNA污染的重要手段，所以无论是扩增还是遗传学分析都应设置阴性和阳性对照。阴性对照是每次PCR实验都必须做的，它包括了标本对照与试剂对照，通过对照确认样本和试剂是否受到污染。阳性对照是对预期结果而设置的，它是PCR反应是否成功的一个重要的参考标志。

3.3 人才培养与培训，提高行业人员能力

定期对相关人员包括现场勘查人员、检材送检人员、物证鉴定人员，进行业务培训和专业知识学习，提高现场勘查能力和防污染意识，改变以往的“老牌作风”和“经验主义”，加强规范操作，确保检材质。

3.4 实验室布局与环境要求要达标

生物物证受理室要和检验区完全隔离开，初步处理室物品要按照受理顺序排好序，并保持洁净，检验人员在进行物证初级处理室做好防护，这是保证样品不污染的第一道程序。原始试剂混配室应为正压间，操作过程在超净台内完成，须防止其他程序功能间对本操作间的污染[8]。PCR扩增室应为微负压区域，必须设置排风系统，以防止大量扩增产物扩散污染其他程序功能间。检测室也应为微负压间，也必须设置排风系统，以防止扩增产物在电泳测序过程中的扩散污染；整个区域要注意温度控制，因为DNA分析仪及其他分析设备散热量较大，会提高室内温度3～5 ℃，所以应做好温度检测。

所有实验区域要进行定期消毒灭菌，紫外灯灭菌在开展实验的2 h前进行，检验区域温度控制在23℃左右。定时清洗维护核心设备，确保结果准确。

4 结语

生物物证检材是DNA分析的原材料，避免检材的污染问题必须做好“人防”和“物防”两方面的工作，这是做好防止污染的第一步，防止DNA检材污染，必须引起基层公安机关物证提取人员的高度重视，这不仅是相关检验人员的责任，也是整个法庭科学从业人员和刑事科学技术人员的责任[9-10]。相关从业人员应该提高自身技能、积极参加培训，在实际现场勘查过程和检验中，严格按照标准操作，严控管理实验室环境卫生，才能保障DNA鉴定结论的真实客观，才能为法庭科学提供可靠依据。本文重点介绍了生物物证检材在现场勘查和分析提取过程中常见的DNA污染途径和环节，并针对各个环节提出了可行性的建议，有望为检验人员在生物物证提取、保存、送检和检验等过程中提供参考。