微滴数字PCR定量检测乳制品中单核细胞增生李斯特氏菌

程逸宇，冯秋实，吴海晶，黄梦静，刘新梅

（南京市食品药品监督检验院，南京211198）

0 引 言

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria.monocytohenes）是一种常见的食源性致病菌[1-2]。世界卫生组织指出，单核细胞增生李斯特氏菌可能污染蔬菜、乳制品、肉制品等常见食品[3]，特别在乳制品中普遍存在[4]。我国对食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测采用培养法[5]，检验周期较长，需要6～7 d才能完成，不能满足乳制品中单核细胞增生李斯特氏菌快速检测的需求[6]。微滴数字PCR(Droplet digital PCR，dd PCR)是新型核酸定量检测技术[7]。该方法在PCR前将含有核酸的反应体系进行微滴化处理，使大部分微滴中的DNA分子数为1或0，依据泊松分布计算出样本中的DNA分子数[8]，实现核酸绝对定量分析[9]。建立单核细胞增生李斯特氏菌dd PCR检测方法，对乳制品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速定量检测具有重大意义。

1 实 验

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌株

单核细胞增生李斯特氏菌（ATCC19115）、大肠埃希氏菌（ATCC25922）、英诺克李斯特氏菌（CICC21671）、伊氏李斯特氏菌（CICC21663）、斯氏李斯特氏菌（CICC10417）。

1.1.2 材料与试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒、qPCR扩增预混液Premix Ex Taq(Takara)；dd PCR扩增预混液dd PCR Super mix for Probes（Bio-Rad）；引物、探针；单核细胞增生李斯特氏菌显色培养基；TSA-YE培养基、营养肉汤。

1.1.3 仪器与设备

生化培养箱，QX 200微滴式数字PCR系统，T 100 PCR仪，CFX 96 Touch荧光PCR仪，冷冻高速离心机。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养

用接种环沾取甘油管保存的单核细胞增生李斯特氏菌(ATCC 19115)标准菌株菌液，在胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA-YE)平板上划线，于37°C培养16 h。挑取单菌落接种于营养肉汤液体培养基，37°C培养至对数生长期备用，采用GB4789.30-2016平板计数法[10]检测菌液浓度。

1.2.2 细菌DNA提取及引物和探针设计

取体积为1 mL菌液，采取Takara细菌DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA，洗脱到100μL TE缓冲液中。参考SN/T 1870-2016[11]，以单核细胞增生李斯特氏菌iap基因为靶基因，合成引物探针，如表1。1

表1单核细胞增生李斯特氏菌PCR引物和探针序列

1.2.3 qPCR和dd PCR反应体系及反应条件

qPCR反应体系(25μL)：12.5μL buffer；浓度为10μmol/L上、下游引物各1μL；浓度为10μmol/L探针0.5μL；模板DNA 1μL；用ddH 2O补至25μL。qPCR反应条件为95°C，3 min；94°C，5 s，60°C，40 s(收集FAM荧光)，40个循环。

dd PCR反应体系：上、下游引物各1.8μL（浓度900 nmol/L），探针0.5μL（浓度250 nmol/L），dd PCR Super mix for Probes 10μL，DNA模板1μL，加dd H 2O至20μL。利用Bio-Rad QX 100数字PCR微滴生成仪将20μL体系混合物生成微滴，再利用Bio-Rad T100 PCR仪进行扩增。dd PCR反应条件为：95℃预变性10 min，94℃变性30 s，60℃退火1 min，40个循环，98℃微滴固化10 min后，4℃保存。PCR反应结束后利用Bio-Rad QX 200微滴分析仪读取DNA拷贝数。

1.2.4 dd PCR检测方法特异性验证

分别挑取单核细胞增生李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、大肠埃希氏菌至营养肉汤中，37°C培养16 h，提取DNA，采用

1.2.3 条件进行dd PCR检测。

1.2.5 dd PCR和qPCR检测方法线性范围

将1.2.2制得的单核细胞增生李斯特氏菌DNA提取液进行10倍梯度稀释，得到终浓度分别为107，106，105，104，103，102，10，1拷贝数/mL的样品，标记为S7-S0。样品取1μL作为模板DNA进行dd PCR和qPCR检测，每个梯度做3次平行检测。

1.2.6 人工污染巴氏乳检测

选取市售巴氏乳，加入1.2.1培养的单核细胞增生李斯特氏菌菌液，梯度稀释，制得含菌量为5×107，5×106，5×105，5×104，5×103，5×102，50 mL-1的人工污染巴氏乳样品。提取样品中细菌DNA，采用qPCR法和dd PCR法分别进行检测，每一样品进行三次重复，比较两种检测方法的检出限（LOD）、定量限（LOQ）及可重复性。

2 结果与分析

2.1 dd PCR检测方法特异性

dd PCR对单核细胞增生李斯特氏菌DNA扩增的实验结果如图1所示。DNA扩增效果良好，其中阳性微滴和阴性微滴明显分成两簇(图1a)，而且中间弥散的微滴数目很少；直方图(图1b)中阳性峰和阴性峰显著分开，中间没有任何干扰，表明ddPCR引物探针和

扩增体系适合对单增李斯特氏菌进行定量分析。

图1 ddPCR方法扩增单核细胞增生李斯特氏菌DNA扩增实验结果

采用李斯特氏菌属4种菌株（单核细胞增生李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌）和常见菌大肠埃希氏菌进行dd PCR检测方法特异性验证。只有单核细胞增生李斯特氏菌得到特异性扩增，其他菌株均为阴性反应，无特异性扩增，如图2，表明单核细胞增生李斯特氏菌dd PCR检测方法具有良好的特异性。

图2 ddPC检测单核细胞增生李斯特氏菌方法特异性实验

2.2 dd PCR和qPCR检测方法线性范围

将单核细胞增生李斯特氏菌DNA提取液梯度稀释，制得DNA浓度为107～1拷贝数copies/mL的样品，标记为S7-S0，进行dd PCR和qPCR检测。所有dd PCR反应生成的微滴数目均大于10 000，表明所有反应微滴生成正常，保证了后续定量分析的准确性。S7至S0样品中，dd PCR产生的阳性微滴数目随着模板DNA浓度降低而降低。在S7中，阳性微滴数与微滴总数接近，表明所有的微滴都有模板DNA分子分布，该浓度下所有微滴均被DNA饱和，无阴性微滴存在，不满足泊松分布，定量结果显著偏离真实值，无法实现dd PCR的准确定量。而在S0中，因模板DNA浓度过低导致没有阳性微滴生成，检测结果为阴性，无特异性扩增如图3所示。实验表明，S6-S1这6个样品均适合dd PCR扩增，能计算出模板DNA浓度，表明dd PCR的检测范围是106～10拷贝数/m L，最低检出限为10拷贝数/mL。根据检测结果绘制标准曲线，样品DNA浓度在106～10拷贝数/mL之间时dd PCR检测结果呈良好的线性关系R2=0.9996，适合定量检测的需要，如图4。

图3 ddPCR各样本生成的微滴数

图4单增李斯特氏菌ddPCR检测标准曲线

qPCR检测结果显示，qPCR可对S7-S3样品进行特异性扩增，扩增曲线正常，如图5，而对S2，S1和S0这三个样品无法检出。这说明qPCR最低检出限为103拷贝数/mL，检测灵敏度低于dd PCR。将测得C t代入标准曲线计算浓度值作图，qPCR线性相关系数R2=0.9980，如图6。从实验结果可以看出，dd PCR检测的标准曲线相关性和最低检出限均优于qPCR检测，表明dd PCR和qPCR相比具有更高的准确度和灵敏度。

2.3 人工污染乳制品检测

对不同菌量污染的巴氏乳进行dd PCR和qPCR检测，结果如表2所示。ddPCR检测人工染菌巴氏乳，当样品含菌量为5×107CFU/mL时阳性液滴过饱和，无法读出准确数值。样品含菌量在5×103～5×106CFU/mL之间时dd PCR检测结果与理论添加值吻合度较高。食品法典(CAC)标准规定，当检出率≥95%时为最低检测下限（LOD），当相对标准偏差RSD≤25%时为定量检测下限（LOQ）[12]。三次重复实验的统计结果显示，样品含菌量在5×102CFU/mL时dd PCR检出率≥95%但RSD≤25%，因此该检测方法的LOD和LOQ分别为5×102CFU/mL和5×103CFU/m L。qPCR检测能对含菌量在5×107～5×103CFU/mL之间样品进行特异性扩增，根据标准曲线计算出的结果重复性较差，且与理论添加值有较大误差。由此可见，dd PCR检测方法在检测灵敏度、准确度及稳定性上均优于qPCR检测方法。

图5单增李斯特氏菌qPCR检测

图6单增李斯特氏菌qPCR检测标准曲线

表2检测人工污染巴氏乳中单核细胞增生李斯特氏菌

比较2.2与2.3中dd PCR检测结果可知，dd PCR检测巴氏乳中单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度远低于直接检测该菌DNA提取液。可能导致这一结果的原因为，细菌DNA提取试剂盒提取低浓度细菌DNA时得率较低，从而使得检测灵敏度降低。由此可见，高效提取样品中低浓度细菌DNA是提高dd PCR检测方法灵敏度的关键。

3 结 论

乳制品是人体受单核细胞增生李斯特氏菌侵染的主要感染源，加强对乳制品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测尤其重要。目前常用的传统培养方法操作简单，但是耗时长，不能满足致病菌检测快速、灵敏的需要，不适用于大规模快速检测。随着检测技术的进步，研究人员开发出实时荧光PCR法（qPCR）[13]、荧光染色法[14]、酶联免疫法（ELISA）[15]等多种快速检测方法。qPCR法具有方便快捷、灵敏度高[16]等优点得到广泛应用，但也存在重复性差、无法准确定量等问题[17]。dd PCR作为一种新的定量检测技术已广泛运用到致病菌检测中[18]。周巍等[19]建立了发酵乳中dd PCR技术定量检测金黄色葡萄球菌的方法，检测特异性良好，检测灵敏度为3.3×101CFU/g。本研究实验运用dd PCR技术对乳制品中的单核细胞增生李斯特氏菌进行检测与精确定量。dd PCR方法简便快速，具有较好的特异性，能对乳制品中单核细胞增生李斯特氏菌含量进行准确测定。ddPCR检测方法对巴氏乳中单核细胞增生李斯特氏菌的最低检出限（LOD）为5×102CFU/mL，定量限（LOQ）为5×103CFU/mL，满足快速定量检测的要求。本方法与qPCR方法相比，具有灵敏度高、精密度高、可重复性好、检测低浓度染菌样品更精确等优点，适合在乳制品企业及食品检测机构中推广运用。