Box-Behnken模型响应面法优化口蘑酸奶发酵工艺

杨帆，李枫，杨凯瑜

（福州大学至诚学院，福州350002）

0 引言

食用菌营养丰富已成为人类的第三大食物来源，并起到较好的食疗功效被广泛应用到食品行业中[1-3]。口蘑（Tricholoma mongolicum Imai）近年来逐渐走入人们的视野，其富含大量矿物元素尤以硒元素为首，仅次于灵芝被誉为“抗癌之王”[4]。因而，口蘑也经常被添加到食品中作为功能食品开发的不二之选，例如，莜面马铃薯口蘑饼干[5]、口蘑黄酮富硒饮料[6]、褐口蘑蜜饯[7]等。酸奶早已成为整个新生代和健康人群首选佳品[8]，如百香果酸奶[9]、大豆酸奶[10]等。将口蘑添加到酸奶中，研制出一款口蘑酸奶，不仅较水果酸奶蛋白含量丰富，且微量元素更胜大豆酸奶，为口蘑综合开发利用开辟一条新的途径，也为食用菌在食品行业中的应用提供思路和参考。本文结合响应面法优化口蘑酸奶工艺，响应面法可将响应值受多个因素影响的问题建模分析，便捷地与随机仿真和确定性仿真问题结合起来，因而越来越多的被应用到各个领域，尤其是食品工业[11]。

1 实验

1.1 材料与仪器

伊利高蛋白脱脂高钙奶粉，市售鲜口蘑，惠宜白砂糖，尚川优养酸奶发酵菌（嗜热链球菌、双歧两歧杆菌TMC3115，德氏乳杆菌保加利亚亚种）。

V-5600型可见分光光度计，SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵，ZCZY-CS8型摇床。

1.2 方法

1.2.1 口蘑酸奶制备(1工艺流程。

(2)口蘑汁的制备。取新鲜口蘑30 g，加90 mL蒸馏水榨汁，混匀过滤制得口蘑汁。

(3)复原乳制备。取16 g乳粉加入200 mL蒸馏水，将白砂糖按比例加入，溶解后放入-4℃冰箱备用。(4)均质、杀菌。将口蘑汁和复原乳按比例混合（不扣除口蘑自身含水量），放入均质机均质，充分溶解后加热至90℃，并保持15 min。

(5)接种、去沫、灌装、发酵。杀菌后的混合乳快速冷却至40℃，然后在无菌操作台上按比例加入发酵剂，混匀后去沫，搅拌均匀后分装在酸奶杯中，封口，42℃恒温培养箱内发酵24 h。

(6)冷却后熟。发酵结束后在室温下冷却20 min，-4℃冷藏至少4 h以上。

1.2.2 感官评定

依据表达力、准时性、对试样态度及健康状况等筛选福州大学至诚学院10名学生作为评分员（18～24岁，7女3男）进行为期3个月的酸奶感官评定[12]训练。每日选取同一时间段（15:00～16:00）评分，评分当天评分员需至少空腹3 h，并用纯净水漱口3次。被评酸奶样品统一用无色透明玻璃杯（200 mL）盛放100 mL。参考国家标准GB 19302-2010《食品安全国家标准发酵乳》[13]适当修改，对口蘑酸奶的色泽10分、香气20分、组织形态35分、滋味35分进行感官评定，见表1，去除一个最高分和一个最低分，取平均值作为最后感官评分数。

表1感官评定指标

1.2.3 单因素实验

考察口蘑汁添加量（质量分数4%，6%，8%，10%，12%，14%，16%）；白砂糖添加量（20，40，60，80，100 g/L，下同）；发酵剂添加量（10，20，30，40，50 g/L）。两组平行实验。

1.2.4 响应面分析

根据单因素实验结果，以口蘑汁添加量、白砂糖添加量、发酵剂添加量三因素进行响应面实验设计[11]，以感官评定分值为响应指标。通过Desigin expert 8.0软件对实验数据进行回归分析，预测口蘑酸奶最佳工艺参数，见表2。

表2响应面实验因素水平

结果分析采用响应面软件Box-Behnken模型设计分析，Sigmaplot Graph作图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 口蘑汁添加量对感官评定的影响

对口蘑酸奶感官评定分值进行统计分析，口蘑汁添加量对感官评定分值的影响差异较大。感官评定的分值随口蘑汁添加量的增加先增大后降低，口蘑汁添加量在12%时，感官评定值达到最大78.8分，之后随口蘑汁添加量增大而下降如图1所示。由于口蘑有些许腥味[14]，添加量超过12%会使口蘑酸奶腥味加重，添加量过低会影响口蘑酸奶营养价值。因此，口蘑汁添加量在10%～14%之间最为合适。

图1口蘑汁添加量对口蘑酸奶感官评定分值的影响

2.1.2 白砂糖添加量对感官评定的影响

固定口蘑汁添加量12%，感官评定的分值随口蘑汁添加量的增加呈现先增大后降低的趋势。在白砂糖添加量60 g/L时，感官评定分值达到最高为81.9分。当白砂糖添加量达到100 g/L时，口蘑酸奶感官评定分值略有增加，可能是甜度过高影响味蕾[15]，导致滋味分值略有增高，同时，白砂糖添加量过多，口蘑酸奶香气更浓，此项评分也略高。白砂糖添加量低于20 g/L时，口蘑酸奶的甜度不足，影响酸奶滋味，而超过100 g/L，口蘑酸奶甜度过高，口感会甜腻[15]。因此，白砂糖添加量选在40～80 g/L之间。

2.1.3 发酵剂添加量对感官评定的影响

将嗜热链球菌、双歧两歧杆菌TMC3115及德氏乳杆菌保加利亚亚种按质量比1∶2∶1混合[16]，可以起到互补作用，在发酵过程中可以相互促进[17-18]。在固定口蘑汁添加量12%，白砂糖添加量60 g/L条件下，口蘑酸奶感官评定分值随发酵剂添加量的增加而缓慢升高，添加量为30 g/L时，感官评定分值最高达85.0分，此后感官评定分值缓慢下降。因此，发酵剂添加量以30 g/L为宜。发酵剂添加量低于10 g/L酸奶发酵不充分，而超过50 g/L会导致发酵过度，不利于酸奶保存[19]。则发酵剂添加量应选在20～40 g/L之间。

图2白砂糖添加量对口蘑酸奶感官评定分值的影响

图3发酵剂添加量对口蘑酸奶感官评定分值的影响

2.2 响应面法优化口蘑酸奶发酵工艺

2.2.1 响应面实验设计及二次多项式回归模型建立

实验共设计17个试验点（见表3），并对实验数据进行分析得出回归方程为

2.2.2 方差分析和二次元回归方程拟合

本实验模型的Prob＞F(a)值，表明该模型极其显著，（见表3）；软件分析得到模型的相关系数R2=0.9910，=0.9794，大于0.9且接近于1，说明模型相关度很好[20]；变异系数(CV)为0.74，该值较低小于1（见表4），反映了此模型的置信度较高，说明此模型方程能很好地反映真实的实验值，因此可以使用此模型来分析响应值的变化[21]。预测值与实际值不拟合的概率通常用模型失拟项表示[22]，此模型失拟项P=0.2295（＞0.05），说明失拟项不显著，模型选择合适，试验误差小，可用此模型对口蘑酸奶的工艺进行分析和预测，见表3。

回归方程(1)中x2，x1x3，x12，x22，x32对口蘑酸奶感官品质的影响极显著（P＜0.01），x1、x3、x1x2对口蘑酸奶感官品质的影响显著（P＜0.05），而x2x3对口蘑酸奶感官品质的影响不显著（P＞0.05）说明发酵剂和白糖添加量交互作用较小，见表3，这可能与发酵菌株对底物糖类物质的依赖性较低有关[18]。优化回归模型得回归方程为

表3口蘑酸奶Box-Behnken模型实验设计结果

可见，口蘑汁、发酵剂和白砂糖添加量对口蘑酸奶色泽、香气、组织形态、滋味影响影响较大。

表4二次回归模型的方差分析结果

2.2.3 交互作用分析

为进一步明晰各因素间的交互作用及确定最佳点，绘制响应曲面图及其投影而成的等高线图，通过观察三维曲面图的倾斜程度、等高线的形状和密集程度来剖析各因素对感官评分结果的影响以及两两因素间的交互作用。曲面坡度越陡峭，影响越显著；坡度越平坦，影响越不显著。椭圆和等高线疏离表明交互作用越显著；圆形和等高线密集表明交互作用越不显著[23]。

图4口蘑汁和白砂糖添加量对口蘑酸奶感官评定分值的影响

图5口蘑汁和发酵剂添加量对口蘑酸奶感官评定分值的影响

固定发酵剂添加量30 g/L，口蘑汁和白砂糖添加量两因素的响应面三维图倾斜程度较大（图4(a)），等高线近似呈现椭圆形（图4(b)），说明两个因素的影响显著，两因素交互作用显著（P＜0.05）[24]。口蘑酸奶的感官评定分数随口蘑汁和白砂糖添加量增加呈现先升高后下降的趋势，口蘑汁添加量轴向等高线更为稀疏，白砂糖添加量轴向等高线相对密集，说明两因素变化时，口蘑汁对感官评定分值的影响相对较大（图4(b)）。此外，响应曲面图开口向下，表明在实验所选范围内存在极大值，在口蘑汁添加量12%～13%、白砂糖添加量50～70 g/L内为最佳水平范围。

图6发酵剂和白砂糖添加量对口蘑酸奶感官评定分值的影响

固定白砂糖添加量30 g/L，口蘑汁和发酵剂添加量两因素的响应面三维图倾斜程度较陡峭（图5(a)），等高线呈椭圆形（图5(b)），说明两个因素的影响极显著，两因素交互作用极显著（P＜0.01）[24]。口蘑酸奶的感官评定分值随口蘑汁和发酵剂添加量的增加先升高后下降，口蘑汁添加量轴向等高线更为稀疏，发酵剂添加量轴向等高线相对密集，说明两因素变化时，口蘑汁对感官评定分值的影响相对较大（图5(b)）。此外，响应曲面图开口向下，表明在实验所选范围内存在极大值，在口蘑汁添加量12%～13%、发酵剂添加量30～40 g/L内为最佳水平范围。

固定口蘑汁添加量12%，发酵剂和白砂糖添加量两因素的响应面三维图倾斜程度较小（图6(a)），等高线近似呈圆形（图6(b)），说明两个因素的影响不显著，两因素交互作用不显著（P＞0.05）[24]。口蘑酸奶的感官评定分值随口蘑汁和白砂糖添加量的增加呈先升后降的趋势，白砂糖和发酵剂的添加量轴向等高线都较为密集，说明两因素对感官评定分值的影响都相对较小（图6(b)）。此外，响应曲面图开口向下，表明在实验所选范围内存在极大值，在发酵剂添加量30～40 g/L、白砂糖添加量50～70 g/L内为最佳水平范围。

综上所述，两因素交互作用的影响显著性由大到小为：口蘑汁和发酵剂添加量交互作用＞口蘑汁和白砂糖添加量交互作用＞发酵剂和白砂糖添加量交互作用。

2.3 最佳工艺确定与验证

口蘑汁、白砂糖和发酵剂添加量对口蘑酸奶的感官评定分值显著影响，经模型预测可得最佳工艺条件为：口蘑汁添加量12.26%，白砂糖添加量64 g/L，发酵剂添加量33.2 g/L，口蘑酸奶的感官评定分值模型预测值为88.76分。便于实验操作，修订工艺条件为：蘑汁添加量12.3%，白砂糖添加量64 g/L，发酵剂添加量33 g/L，在此条件下进行三次验证实验，测得实际口蘑酸奶的感官评定分值为(88.93±0.37)分，与预测值偏离在0.19%左右。

3 结论

以感官评定分值为指标，利用响应面的Box-Behnken模型研究了口蘑汁、白砂糖和发酵剂添加量对口蘑酸奶感官评定分数的影响,建立二次多项式模型（P＜0.001），在分析预测最优组合的基础上，通过实验验证最终获得优佳工艺：蘑汁添加量12.3%，白砂糖添加量64 g/L，发酵剂添加量33 g/L，口蘑乳酸菌酸奶的感官评定分数(88.93±0.37)分。所得产品奶香浓郁并散发口蘑独特的香味，口感丝滑鲜美，则应用响应面法研究食用菌乳酸菌酸奶工艺是切实可行的，且为食用菌的开发和利用提供新的思路和参考。