嗜热链球菌MN002冻干菌粉的制备工艺

李周勇，王凡，栾少萌，陈建国，康小红

（内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司研发中心，呼和浩特011500）

0 引 言

嗜热链球菌是乳制品行业最常见的发酵剂之一，广泛应用于各种发酵乳制品的生产[1]。嗜热链球菌菌粉的生产过程中，菌体分离及干燥技术最为关键[2]。因此，必须选择合适的离心条件及蛋白溶解剂以提高菌体存活率[3]。冷冻干燥技术是目前全球范围内乳酸菌保藏使用最广泛及成熟的技术[4]。真空冷冻干燥过程中，冷冻速率、菌体浓度、冻干保护剂、贮存条件等都会对菌体存活率造成显著影响[5]。本文对不同离心条件、蛋白溶解剂及冻干保护剂对嗜热链球菌MN 002冷冻干燥的效果进行了研究，通过比较离心前后活菌数的变化及菌体存活率[6]，筛选出嗜热链球菌MN 002最佳的离心条件及冻干保护剂组合，为嗜热链球菌MN 002冻干菌粉的工业化生产提供理论依据和技术支持。

1 实 验

1.1 材料

菌种：嗜热链球菌MN 002（蒙牛自主知识产权菌种库保藏菌株，使用超低温冰箱于-80℃保存）。

试剂：脱脂乳粉（雀巢）、蔗糖、乳糖、海藻糖、麦牙糖、糊精、抗坏血酸、甘油醇、吐温80、甘油、蛋黄粉、谷氨酸钠、氢氧化钠、六偏磷酸钠、柠檬酸钠、MC琼脂培养基，其他化学试剂均为分析纯。

1.2 设备

DHP-9052电热恒温培养箱，武汉科辉；ALPHA 1-4 LD plus真空冷冻干燥机，德国christ公司；Bio-StatB生物发酵罐，德国贝朗公司；G560E漩涡混合器，美国SCIENTIFIC Instruments公司；Premium U 410超低温冰箱，美国NBS公司；PB-10 pH计，北京赛多利仪器系统有限公司；CP21GⅡ高速冷冻离心机，日立公司；ML51生物显微镜，日本Olympus；ACB-6A1超净工作台，新加坡ESCO公司。

1.3 方法

1.3.1 冻干菌粉制备工艺[7]

菌种高密度培养→菌体离心富集→加入冻干保护剂→预冻处理→真空冷冻干燥

1.3.2 离心条件的控制

用无菌吸管将最优条件下培养的嗜热链球菌MN 002培养物移入灭菌离心管中，上机离心，固定离心时间为5 min[8]，以菌体离心存活率及发酵液菌体离心浓缩倍数为指标[9]，对离心转数和温度进行筛选。测定离心前发酵液中活菌数记为离心前活菌数，离心后迅速弃上清，加入灭菌生理盐水至离心前体积，测得离心后沉降菌体活菌数。

菌体离心存活率=离心后沉降菌体活菌数/初始发酵液活菌数×100%，

菌体离心浓缩倍数X=W/（W-W 1），

式中：W为测量时所取的10 g发酵菌液；W 1为发酵菌液经转速3 000 r/min离心10 min所得的上清液质量。

1.3.3 蛋白洗脱液配方优化[10]

选取蛋白洗脱剂六偏磷酸钠和柠檬酸钠[11]，单独和混合复配使用。蛋白洗脱剂预先用少量蒸馏水溶解，再按浓度要求添加到增菌结束后的菌体培养液中混合均匀，20℃保持60 min[12]，在最优离心条件下离心，按1.3.2的方法测定菌体浓缩倍数。

1.3.4 冻干保护剂单因素筛选

嗜热链球菌MN 002的冻干悬浮基质采用15%的脱脂乳[13]，按表1分别加入不同种类和浓度的保护因子，在100 mL三角烧瓶中充分混合并灭菌。按离心后的菌体2倍量充分混合制成菌体悬浮液，取1 mL菌体冷冻悬浮液移入西林瓶中，在冻干机中真空冻干，测定冻干后菌体的存活率[14]。

表1不同冻干保护因子的种类和添加量

1.3.5 复合冻干保护剂二次旋转正交优化

根据单因素实验结果，选取其中5种对菌体存活率有显著影响的保护剂，以10%脱脂乳为基础物质[15]，运用五因素二次旋转正交组合设计优化嗜热链球菌MN 002保护剂配方。实验因素水平编码如表2所示。

表2实验因素水平编码 %

1.3.6 其他指标测定方法

（1）活菌数测定[16]

按GB4789.35采用MC琼脂培养基对嗜热链球菌MN 002进行活菌计数（37℃需氧培养72 h，记录菌落数）。

（2）冻干存活率

使用生理盐水适当稀释冻干菌，MC琼脂培养基倾注平板，在37℃培养箱中培养72 h后计数菌落数，其冻干存活率为

冻干存活率=冻干后活菌数/冻干前活菌数×100%。

2 结果与分析

2.1 离心条件的选择

固定离心时间为5 min，在不同离心转数及温度条件下，菌体离心存活率及离心浓缩倍数如表3所示。

表3不同离心条件下嗜热链球菌MN002的离心效果

由表3可以看出，在转速为8 000 r/min的高分离转速条件下，4℃低温组的存活率为80.0%，显著高于25℃室温组的48.3%(p＜0.01)；在4℃低温条件下，转速为8 000 r/min高分离转数的存活率同样显著高于低分离转数的活率(p＜0.01)。因此离心法浓缩菌体采用低温和高分离转数对菌数存活比较有利，这与胡仲秋等的研究结果一致[17]。实验最终确定最佳离心条件为，离心转速8000r/min，离心温度4℃。

通过表3中的数据还可以看到，各实验组菌体浓缩倍数均不是太高，分析原因，可能是在浓缩物中，由于嗜热链球菌MN002产酸使得部分蛋白沉淀，并随同菌体一起离心分离，这在很大程度上降低了离心效果[18]。因此，实验下一步将对蛋白溶解剂进行优化，以获得最优的菌体浓缩效果。

2.2 蛋白洗脱液配方优化结果

增菌发酵过程中乳蛋白发生一定程度变性，使离心沉淀物中伴随有大量乳蛋白质，菌体浓缩倍数受到限制，为此选择蛋白洗脱剂六偏磷酸钠和柠檬酸钠[19]，并将其单独和复配添加到增菌结束后的菌体培养液中，20℃保持60min后，于4℃条件下，转速为8000 r/min离心处理5min，菌体浓缩倍数测定结果如表4所示。

表4添加复合盐类的菌体离心浓缩倍数

由表4可以看出，蛋白洗脱液的加入大大提高了菌体浓缩倍数，且将蛋白洗脱剂六偏磷酸钠和柠檬酸钠复配使用的效果明显优于洗脱剂单独作用，以第四组实验中的0.15%六偏磷酸钠和0.5%柠檬酸钠配合及第五组实验中的0.20%六偏磷酸钠和0.5%柠檬酸钠复配洗脱效果最好，考虑到生产成本，最终我们选择0.15%六偏磷酸钠和0.5%柠檬酸钠复配，作为最佳的蛋白洗脱液组合。

2.3 冻干保护剂单因素筛选结果

菌体冷冻干燥后的存活率受多种因素的影响，而保护介质是其中重要的影响因素，良好的保护剂要求其在冻干过程中能提供菌体保护作用，降低菌体死亡，同时能有较好的自身稳定性且有利于再水合，还可方便有效的除去冻干材料中的多余溶剂[20]。试验以15%的脱脂乳为对照，对嗜热链球菌冷冻干燥保护效果较好的大分子、盐类、糖类及单分子等多种保护剂进行了研究，以筛选适合嗜热链球菌MN002的冻干保护剂。

由表5可以看出，除蛋黄由于冻干后与菌体粘在一起，十分黏稠未能检出，其它所选保护剂对嗜热链球菌均有一定的保护效果。其中甘油醇、吐温80、糊精对菌体冻干保护作用相当(p＞0.05)，对菌体存活率提高较少。海藻糖、抗坏血酸、甘油及谷氨酸钠对菌体冻干保护作用相当(p＞0.05)，对菌体存活率提高最大。海藻糖与甘油是应用较为广泛的冻干保护剂[21]，在本试验中它们的效果较好。许多研究发现谷氨酸钠可以提高大多数乳酸菌冷冻和冷冻干燥的存活率，这与本研究结果一致，这是因为谷氨酸钠氨基基团与微生物蛋白质的羟基基团之间的反应稳定了蛋白质的结构，且保留了较大的水分含量[22]。蔗糖、乳糖、麦芽糖效果相当(p＞0.05)，对菌体存活率提高较大，从应用范围及成本考虑，选取蔗糖作为其中一个主要保护因子。因此，我们最终选择蔗糖、海藻糖、抗坏血酸、甘油及谷氨酸钠作为主要影响因子，进行下一步优化实验。

表5嗜热链球菌MN002冻干保护剂单因素实验结果

2.4 复合冻干保护剂优化结果

在单因素试验的基础上，选取蔗糖、海藻糖、抗坏血酸、甘油及谷氨酸钠作为保护剂组分，按表2的水平设置，采用二次旋转组合设计对嗜热链球菌MN002的复合冻干保护剂进行优化，冻干后嗜热链球菌MN002存活率如表6所示。

2.4.1 保护剂模型及分析

以嗜热链球菌MN002菌体存活率（Y）为响应值，采用DPS数据处理软件进行多元回归分析，得到多元二次回归模型如下：

式中：x1，x2，x3，x4，x5分别为蔗糖、甘油、谷氨酸钠、抗坏血酸、海藻糖质量分数的编码值。

由表7可以看出：F1=0.2987＜F0.05(6，9)=3.69，F2=17.4351＞F0.01(20，15)=3.37。F1检验通过，说明二次正交旋转组合设计所选择的5个因素（蔗糖浓度、甘油浓度、谷氨酸钠浓度、抗坏血酸浓度、海藻糖浓度）是最主要因素，并无其他主要因素，实际规律满足二次方程条件，无更高次项的干扰。F2检验通过说明回归模型是显著的，与实际情况拟和的较好。

利用t检验在ɑ=0.01显著水平对模型中各回归系数进行有效性检验，剔除不显著项后，模型（1）回归方程可简化为

Y=0.8430-0.0653x12-0.0654x22+0.0064x3-0.0723x32+0.0072x4-0.0658x42+0.0060x5-0.0683x52， （2）

表6二次回归旋转组合设计及实验结果

表7方差分析结果

各因素对指标值的贡献率为x1=5%，x2=2%，x3=0.8%，x4=1%，x5=5%；x3(0.9872)＞x5(0.9864)＞x4(0.9853)＞x1(0.9843)＞x2(0.9837)，即谷氨酸钠质量分数＞海藻糖质量分数＞抗坏血酸质量分数＞蔗糖质量分数＞甘油质量分数。

2.4.2 单因素分析

将模型中的4个因素分别固定在（-2，-2）、（0，0）、（2，2）的水平上，对第5个因素进行单因素分析，得到5个因素分析结果如下图1-图5所示。

图1蔗糖对MN002的保护作用

图2甘油对MN002的保护作用

图3谷氨酸钠对MN002的保护作用图

图4抗坏血酸对MN002的保护作用

图5海藻糖对MN002的保护作用

由图1-图5可以看出，每种保护剂对冻干存活率的单因素影响趋势基本一致，均为抛物线关系，MN 002存活率随各保护剂浓度的增加先增加至某一极值点后又开始下降。每组曲线中曲线2的值均高于曲线1和曲线3，这说明5种保护剂单独作用时，其他4种保护剂在零水平附近利于其保护作用的发挥。

2.4.3 双因素分析

将模型B中每三个因素一组，固定在零水平，就可得到另外二个因素对冻干存活率影响的子模型，根据该子模型，可分别绘制每两因素协同作用对存活率影响的曲面图。本研究为五因素旋转设计，因此可得 10个子模型和相应10组曲面图，如图6所示。

图6两因素协同作用对MN002存活率的影响

由图6可以看出，保护剂两因素协同作用对MN 002冻干存活率的影响具有很大相似性。每组曲面的影响趋势均表现为：当因素1为固定水平时，指标值随因素2的增加而增加，增加至某一值后，又随因素2的增加而降低，当因素2为固定水平时，因素1的变化趋势也是如此，只是部分曲面的走势略有不同。例如以图6（a）为代表，蔗糖与甘油协同作用时，MN 002冻干存活率升降趋势较明显，以图6（e）为代表，甘油与谷氨酸钠协同作用时，MN 002冻干存活率升降趋势较平缓。两因素均取适中值时，容易获得较大存活率，这与单因素分析的情况对应。另外，从图6（a-d）比较可知，已知较为有效的保护剂蔗糖与其它渗透性保护剂和非渗透性保护剂之间的协同作用区别不大，从图6（c）可见蔗糖与抗坏血酸钠的协同作用较好。

2.4.4 验证实验

通过回归模型方程式求Y极值，可得在本试验条件下，菌体存活率的理论极值F max=84.8%，此时最佳保护剂组合为x1=5%，x2=2%，x 3=0.8%，x 4=1%，x5=5%；即蔗糖质量分数5%，甘油质量分数2%，谷氨酸钠质量分数0.8%，抗坏血酸质量分数1%，海藻糖质量分数5%。在实验所得最佳条件下进行重复实验验证，MN 002菌体存活率可达84.2%，与理论极值接近，进一步验证了保护剂模型的合理性。

3 结 论

试验对不同离心条件下嗜热链球菌MN 002的存活率进行了研究，发现在离心转速为8 000 r/min，离心温度4℃条件下，菌体离心存活率最高。同时，以菌体浓缩倍数为指标，对蛋白洗脱剂进行了组合研究，发现0.15%六偏磷酸钠和0.5%柠檬酸钠配合使用效果最好，可大大提高MN 002菌体浓缩倍数。

以嗜热链球菌MN 002冻干存活率为指标，通过单因素实验和二次正交旋转组合设计实验，建立了冻干存活率与蔗糖质量分数、甘油质量分数、谷氨酸钠质量分数、抗坏血酸质量分数以及海藻糖质量分数的回归模型，该模型与实际拟合性好，能有效反映实际情况。通过对回归方程进行分析，得到了最佳的菌体冻干保护剂组合：蔗糖为5%，甘油为2%，谷氨酸钠为0.8%，抗坏血酸为1%，海藻糖为5%（均为质量分数），MN 002菌体存活率的理论极值为84.8%。各因素对菌体存活率的影响大小为谷氨酸钠质量分数＞海藻糖质量分数＞抗坏血酸质量分数＞蔗糖质量分数＞甘油质量分数。