哮喘儿童支气管肺泡灌洗液中几丁质酶和真菌特异性抗体的检测水平及意义

韩小胜,黄 会，魏小斌

(海南省海口市人民医院检验科 570208)

儿童哮喘近年来发病率逐渐上升，严重影响其生长发育及身心健康[1]。目前较多文献报道哮喘的发病与外界环境中的过敏原如尘螨、真菌等密切相关[2]，此外酸性哺乳动物几丁质酶(acid mammals chitinase，AMcase)引发的炎性反应与哮喘的发生也有关系[3-4]，但目前真菌特异抗体及AMcase是否参与哮喘疾病发展的报道不多。本研究通过收集本院哮喘患儿支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，对其中AMcase和真菌特异性抗体进行检测，探究AMcase、真菌特异性抗体与哮喘严重程度的关系，为治疗儿童型哮喘提供一定的参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2015年7月至2016年11月本院收治的96例支气管哮喘患儿作为研究对象，其中男57 例，女39 例，年龄2～12 岁，平均(5.84±2.57) 岁，符合儿科哮喘防治协会规定的哮喘诊断标准，根据全球哮喘防治策略(GINA)分级标准[5]将患儿分为轻度组(54 例)、中度组(26 例)、重度组(16 例)，另选取同期经纤维支气管镜为支气管异物儿童30 例作为对照组，其中男18 例，女12 例，年龄1～11 岁，平均(5.65±2.38) 岁，两组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。纳入标准：(1)入选患儿均符合儿科哮喘防治协会规定的哮喘诊断标准[6]；(2)年龄小于或等于12岁；(3)患儿家属知情同意。排除标准：(1)个人或家族具有哮喘病史；(2)喉软化及支气管狭窄等先天因素导致；(3)心、肝、血液等系统慢性病症；(4)合并慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张、呼吸衰竭等肺部疾病者；(5)不能配合完成检测者。

表1 各组患儿临床指标比较

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与轻度组比较；c：P<0.05，与中度组比较

1.2方法

1.2.1BALF收集 所有哮喘患儿取左肺舌叶病变部位支气管肺段灌洗，对照组取病灶对侧肺段灌洗，采用37 ℃消毒生理盐水灌洗，使用量为150 mL，浓度为0.5 mL/kg，使用回收率超过60%，过滤BALF离心后保留上清液放置-20 ℃中保存，下层细胞采用血细胞计数器测定细胞总数，选取200个细胞进行细胞分类统计。

1.2.2酶联免疫法测定BALF上清液中免疫球蛋白E(IgE)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)含量 参照相关文献结合本地空气中较多真菌类型，对BALF上清液进行真菌特异性抗体水平测定，IgE酶联免疫试剂盒购于美国R&D公司，IgA、IgG酶联免疫试剂盒购于美国RayBiotech公司，参照试剂盒进行操作。

1.2.3反转录PCR测定BALF上清液中AMcase mRNA表达 采用RNA提取试剂盒(Takara公司)提取BALF上清液中RNA进行提取，反转录为cDNA。反应体系：10×cDNA模板1.0 μL,上下游引物各0.5 μL,H2O 8.0 μL,2×SYBR Mix 10.0 μL。按照反应程序95 ℃ 3 min，94 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，30个循环，72 ℃ 10 min。利用CFX manager 3.0软件进行Cq值分析,按照2-ΔΔCq算法进行定量表达分析。

1.2.4Western blot检测BALF中AMcase表达 在BALF上清液中加入蛋白裂解液在冰上进行30 min裂解反应，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳结束后在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上行转膜反应，TBST溶液清洗后，加入5%脱脂牛奶封闭后，加入AMcase一抗稀释液(美国R&D公司)，4 ℃振荡过夜，加入二抗稀释液(美国R&D公司)，室温下孵育2 h，磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗后用凝胶成像仪对蛋白表达结果进行分析。

2 结 果

2.1各组研究对象临床指标对比 不同程度哮喘患儿中性粒细胞比例、巨噬细胞比例、嗜酸性粒细胞比例均高于对照组，淋巴细胞比例低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2BALF上清液中真菌感染及特异性IgE、IgA、IgG含量 哮喘患儿真菌感染主要为青霉菌、曲霉菌、链铬孢和白色念珠菌。不同程度哮喘患儿BALF上清液中特异性IgE水平均高于对照组，特异性IgA、IgG均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2～5。

表2 各组感染真菌情况(n)

2.3反转录PCR法测定BALF上清液中AMcase mRNA表达 不同程度哮喘患儿BALF上清液AMcase mRNA表达水平均高于对照组，AMcase mRNA表达水平逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

a：P<0.05，与重度组比较；b：P<0.05，与中度组比较；c：P<0.05，与轻度组比较

表3 BALF上清液中真菌特异性IgE水平

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与轻度组比较；c：P<0.05，与中度组比较

表4 BALF上清液中真菌特异性IgA水平

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与轻度组比较；c：P<0.05，与中度组比较

表5 BALF上清液中真菌特异性IgG水平

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与轻度组比较；c：P<0.05，与中度组比较

图2 BALF中AMcase蛋白的表达

表6 BALF中AMcase蛋白扫描灰度值

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与轻度组比较；c：P<0.05，与中度组比较

2.4Western blot检测BALF中AMcase蛋白表达 与对照组比较，不同程度哮喘患儿BALF中AMcase蛋白表达逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2、表6。

3 讨 论

支气管哮喘临床特征主要表现为反复性喘息、胸闷、呼吸困难且在清晨或夜间症状加剧[7]。过敏原广泛存在空气中并在哮喘的发病中起着关键性作用，暴露在空气中的真菌孢子是哮喘患者重要的过敏原[8]。此外AMcase是引发哮喘的重要介质，尤其是病情严重的哮喘，本研究通过检测不同程度哮喘患儿BALF中AMcase及真菌特异性抗体，进而探究哮喘发病机理。

以往研究认为哮喘主要病理特征为嗜酸性粒细胞浸润[9-10]，动物研究结果显示在小鼠BALF中嗜酸性粒细胞高达70%，而中性粒细胞比例较低[11]。有研究发现在轻度、中度患者中以嗜酸性粒细胞浸润为主，而重度哮喘患者中性粒细胞比例明显增加，且与病情严重程度呈正相关[12]。本研究结果显示哮喘患儿中，中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞比例随着病情程度的加重逐渐升高，淋巴细胞比例逐渐降低，表明中性粒细胞水平升高可能是导致哮喘的主要因素。

真菌在周围空气中较常见，如青霉菌、曲霉菌、草分支孢子菌等，进入气道后定植，刺激机体产生毒素及酶辅助炎性反应[13]。国外研究显示草分支孢子菌致敏率的增加，患者哮喘加重[14]。此外研究显示在ICU的哮喘患者中，草分支孢子菌、青霉菌等真菌致敏患者超过50%，且与患者哮喘程度呈正相关[15]。本研究结果显示青霉菌、曲霉菌、链铬孢、白色念珠菌特异性抗体随着病情加重，IgE水平逐渐升高，IgA、IgG水平逐渐降低，与邹晖等[16]研究相符，表明真菌特异性IgE与哮喘患儿病情有关，可能作为评估哮喘病情的指标。

AMcase为哺乳动物体内几丁质酶，可通过影响辅助T细胞2(Th2)炎症因子的表达参与哮喘的发病[17]。微生物研究证实AMcase能够水解真菌细胞壁的重要组成成分-几丁质，对于真菌具有较好的抗菌性[19]。BIRBEN等[20]研究证实机体受到含有几丁质病原菌刺激会后机体内AMcase水平明显升高，进一步诱发EOS聚集反应，在哮喘等过敏性疾病中发挥重要作用。本研究结果显示随着哮喘病情程度的加重，BALF中AMcase表达逐渐升高，表明在受到过敏原刺激后AMcase表达水平逐渐升高，进而导致疾病程度加重，可能作为哮喘病情的指标。

总之，哮喘患儿BALF中AMcase、真菌特异性抗体水平与病情严重程度相关，可作为评估哮喘病情的指标，为临床治疗哮喘提供一定的参考。本研究也存在一定的局限性，样本量较小，未对空气中其他过敏原进行检测使结论受到一定限制，后续应深入研究。