MTRR 66A>G基因多态性与410例原发性男性不育患者的相关性研究*

郭谦楠，王 莉，李 涛，肖 海，冯战启，刘红彦，候巧芳,3，康 冰,3，廖世秀,3△，龙建纲

(1.河南省人民医院/郑州大学人民医院医学遗传研究所，郑州 450003；2.西安交通大学生命科学与技术学院线粒体生物医学研究所，西安 710049；3.河南诚信法医临床司法鉴定所，郑州 450003；4.河南大学附属郑州市第一人民医院泌尿外科，郑州 450000)

10%～15%的夫妇会出现不育，且其中约50%是由于男性的原因导致。而男性不育中有15%～30%是基因异常所致。睾丸功能相关的关键基因及受环境影响的关键易感基因中，有害的基因多态性可能与男性不育中精子数量少及精子活力低下的发生有关。

5,10-亚甲基四氢叶酸(MTHFR)和蛋氨酸合成酶还原酶(MTRR)是叶酸代谢途径中的关键酶。MTHFR 677C>T基因多态性已被认为与男性不育有关[1-2]。然而，MTRR与男性不育的相关性研究报道存在很大分歧。在波兰人群中，MTRR 66A>G与非梗阻性男性不育无关[3]；在约旦人群中，MTRR 66A>G与男性不育中的无精子症和少精子症无关[4]。而在韩国人群中，MTRR 66A>G与非梗阻性男性不育有关，但分组分析时MTRR 66GG基因型只与少弱精子症有关而与无精子症无关[5]。并且，在最近两篇关于中国人群的报道中：NI等[6]发现MTRR 66A>G与男性不育(只含有无精子症和少精子症患者)无关；但LI等[7]发现MTRR 66A>G与男性不育有关，但与非梗阻性男性不育的无精子症无关且只与少弱精子症有关。这些研究提示MTRR 66A>G基因多态性似乎与男性不育中的无精子症和少精子症无关但与少弱精子症有关，由此提出假设：MTRR 66A>G基因多态性与男性不育中的精子数量无关但与精子活力有关。为了探究假设是否成立，本研究选取了不同类型精子异常的原发性男性不育患者进行精子数量和活力与MTRR 66A>G基因多态性相关性研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年8月至2017年1月河南省人民医院确诊为原发非梗阻性不育的河南汉族男性患者(病例组410例)：染色体核型和性别决定基因(SRY)检测均正常，并且无隐睾、精索静脉曲张、泌尿生殖道感染和性病；其中，少弱精子症167例，无精子症113例，弱精子症103例，少精子症11例，隐匿精子症16例；年龄25～41岁，相互间无血缘关系，无不良性生活史。选取同期在河南省人民医院产科生育正常胎儿且无辅助生殖史的健康孕妇的丈夫389例为对照组，与病例组生活环境相似(均为居住和出生在河南并无血缘关系的河南籍汉族人)，年龄在23～44岁。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取 抽取外周静脉血2 mL,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，-20 ℃保存。利用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒提取DNA。

1.2.2PCR-直接测序分析 (1)MTRR 66A>G多态性位点扩增的引物序列同文献[8]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，蒸馏水稀释至10 μmol/L。反应条件为95 ℃预变性5 min,94 ℃ 30 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 32 s共40个循环，随后72 ℃延伸9 min。PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司，运用下游引物进行PCR产物DNA测序。

1.3统计学处理 采用SPSS13.0 软件进行数据分析，计数资料以频数或百分率表示，比较采用χ2检验，计算比值比(OR)评价相对危险度，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1MTRR 66A>G基因多态性的分布 经Hardy-Weinberg平衡检验,对照组和病例组及其各分组的基因型分布达到遗传平衡(P>0.05),具有群体代表性。MTRR 66A>G位点的G等位基因频率在对照组为20.7%,病例组总体为25.5%(209/820)，见表1。

2.2MTRR 66A>G基因多态性与不同类型分组的原发性男性不育的相关性 等位基因G或GG基因型与少弱精子症和弱精子症的发生相关，等位基因G的分布在少弱精子症和弱精子症病例组中均显著增高(P<0.05)，G是A发生少弱精子症的1.392倍， G是A发生弱精子症的1.431倍；GG基因型的分布在弱精子症病例组中显著增高(P<0.05)，GG是AA发生弱精子症的3.812倍；等位基因G及AG和GG基因型分布在隐匿精子症、无精子症和少精子症中差异无统计学意义(P>0.05)，见表2、3。

表1 MTRR 66A>G基因多态性的分布[n(%)]

表2 病例组各分组与对照组中G等位基因分布的比较(n)

续表2 病例组各组与对照组中G等位基因分布的比较(n)

表3 病例组各组与对照组中AG和GG基因型分布的比较

-：无数据

2.3MTRR 66A>G 基因多态性与精子数量低下的原发性男性不育的相关性分析 MTRR 66A>G与精子数量低下的原发性男性不育的发生无相关性(P>0.05)。等位基因G和GG及AG基因型的分布与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05),见表4。

表4 精子数量低下的原发性男性不育组中的MTRR 66A>G多态性位点与对照组分布的比较

精子数量低下=隐匿精子症+无精子症+少精子症

2.4MTRR 66A>G 基因多态性与精子活力低下的原发性男性不育的相关性分析 等位基因G和GG基因型与精子活力低下的原发性男性不育的发生有相关性，G是A发生精子活力低下的原发性男性不育的1.407倍， GG是AA发生精子活力低下的原发性男性不育的2.867倍，见表5。

表5 精子活力低下的原发性男性不育组中的MTRR8 66A>G基因多态性与对照组分布的比较

续表5 精子活力低下的原发性男性不育组中的MTRR 66A>G基因多态性与对照组分布的比较

精子活力低下=少弱精子症+弱精子症

2.5MTRR 66A>G基因多态性与病例组的关系 等位基因G和GG基因型与原发性不育的发生显著相关(P<0.05)：G是A发生男性不育的1.311倍，GG基因型是AA基因型发生男性不育的2.489倍，见表6。

表6 两组中G等位基因及AG和GG基因型分布的比较

3 讨 论

MTRR 66A>G突变导致位于MTRR蛋白第22位的异亮氨酸转变为蛋氨酸，可使其酶活性降低[8]。MTRR缺陷在人类和小鼠中被发现可导致血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平的升高[9-11]。高血浆Hcy可能与心脏病[12]和妊娠期糖尿病[13]的发生有关，并且可诱导骨髓间质干细胞凋亡[14]。

在基因改造的MTRR酶活性极低的小鼠中，MTRR酶缺陷可导致高血浆Hcy,但并不影响胚胎的存活率和出生率[15],揭示在小鼠中MTRR及高血浆Hcy可能与生育能力及胚胎的存活性无相关性。在人类研究中，女性的MTRR 66A>G基因多态性与胎儿唐氏综合征或胎儿室间隔缺损的发生显著相关[16-17]；然而，在男性研究中，MTRR 66A>G基因多态性与男性不育的相关性却存在分歧。本研究中发现，MTRR 66A>G突变可能与少弱精子症的发生有关但却与无精子症的发生无关，这与先前国内外的一些报道相符合[4-7]；MTRR 66A>G基因多态性与弱精子症有关为本研究首次在国内明确阐明；MTRR 66A>G基因多态性与隐匿精子症无关也为本研究首次在国内明确阐明。

本研究中发现，MTRR 66A>G基因多态性与精子活力低下的原发性男性不育的发生有关(P<0.05)，但与精子数量低下的原发性男性不育的发生无关(P>0.05)。此研究发现可能是造成MTRR 66A>G基因多态性与男性不育相关性存在分歧的重要原因之一。因为在不同研究中，无精子症、少精子症、少弱精子症或弱精子症患者所占比例不同，从而造成各个研究的差异。本研究中，精子活力低下共270例患者，而精子数量低下共140例患者，精子活力低下是精子数量低下患者例数的1.93倍，这可能是当研究MTRR 66A>G基因多态性与原发性男性不育(精子活力低下的原发性男性不育和精子数量低下的原发性男性不育合并分析)之间相关性时本研究能得出存在相关性结论的原因。

精子活力是精子运动能力的体现。通过本研究，可提出推论：MTRR 66A>G基因多态性与男性不育之间的相关性可能是由于MTRR 66A>G突变引发精子运动能力低下造成的。因此，当研究对象的大多数存在精子活力低下时便会得出MTRR 66A>G基因多态性与男性不育之间存在相关性。相反，当研究对象中的大多数为精子数量低下而非活力低下时便会得出MTRR 66A>G基因多态性与男性不育之间无相关性。

核黄素是MTRR的辅酶。研究发现，高核黄素饮食可以改善MTRR 66A>G突变对血浆Hcy水平升高的影响[18]。国内外已有大量研究表明高叶酸或核黄素饮食可以预防与MTRR 66A>G基因多态性有关的不良妊娠结局的发生。因此，对具有MTRR 66A>G基因多态性高风险基因型的男性增加核黄素的摄入量可能对提高男性精子质量有帮助，从而对预防不良妊娠结局的发生起到一定作用。