1,25(OH)2D3联合铂类对原代培养肺癌细胞的杀伤作用*

刘洪梅，王希柱，刘 静，邱 斌,韩素桂，陈艳梅

(河北省唐山市人民医院：1.核医学检验科;2.心内科;3.体检中心;4.胸外科 063000)

晚期非小细胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer,NSCLC)患者无法行根治性手术，可选择铂类为基础的两药联合治疗手段。以铂类为基础的化疗药能够控制症状，改善生活质量，是现在晚期NSCLC标准的治疗方案，临床治疗时产生的不良反应及部分患者对化疗的耐受性差等问题限制了铂类足量使用。近年医学研究中发现1,25-二羟基维生素D3[1,25(OH)2D3]参与调节机体免疫功能，减少多种炎性因子表达，发挥多种生物学功能[1-2]，还可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞分化、促进细胞凋亡等方式来发挥抗肿瘤作用[3-4]。本实验通过观察铂类药物与1,25(OH)2D3联合作用对原代肺癌细胞的杀伤作用，探讨1,25(OH)2D3对铂类抗癌药物的增敏作用，为肺癌的综合治疗提供依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1细胞与试剂 选取2017年1-5月本院胸外科收治的伴有恶性胸腔积液患者5例，经病理学或细胞学证实为NSCLC，其中腺癌4例，鳞癌1例。试剂：1,25(OH)2D3购自美国Sigma公司，溶于无水乙醇并配成储备液，-20 ℃储存备用；CCK-8购自同仁化学研究所；细胞周期检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；顺铂(DDP)注射液、卡铂(CBP)注射液、奈达铂(NDP)购自山东齐鲁制药有限公司。

1.2方法

1.2.1原代肺癌细胞培养 无菌常规胸腔穿刺留取胸腔积液，1 000 r/min离心10 min，弃去上清液，磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤2次，用无血清RPMI-1640培养液重悬，按细胞悬液∶Ficoll液体积比2∶1，将细胞悬液缓慢贴壁加入含Ficoll液的离心管中，水平离心机2 000 r/min离心15 min，离心后吸取Ficoll液面上方乳白色液体，加入无菌离心管中，加适量PBS洗涤2次，每次1 000 r/min离心5 min。将洗涤后的细胞用含10%血清RPMI-1640培养液重悬，37 ℃、5% CO2的培养箱中常规培养24 h，弃去上清液，加入含10%血清RPMI-1640培养液继续培养待细胞贴壁80%时，传代用于后续实验。

1.2.2CCK-8法检测细胞抑制率 取对数生长期的肺癌细胞，台盼蓝染色活细胞计数调整细胞浓度2×104个/孔接种于96孔培养板，置37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h，细胞贴壁后弃去培养液，加入含不同浓度药物的培养液200 μL。单纯肺癌细胞培养作为对照组；实验药物组分为7组：DDP组，浓度分别为1、2、4、8和16 μg/mL；CBP组，浓度分别为5、10、25、50和100 μg/mL；NDP组，浓度分别为1、2、4、8和16 μg/mL；1,25(OH)2D3组，浓度分别为10、20、40、160和320 ng/mL；联合药物组，为DDP(4 μg/mL)+1,25(OH)2D3(20 ng/mL)、CBP(50 μg/mL)+1,25(OH)2D3(20 ng/mL)、NDP(6 μg/mL)+1,25(OH)2D3(20 ng/mL)。每组均设5个复孔，继续培养至加药后24、48、72 h每孔加入20 μL的CCK-8，继续孵育2 h，用酶联免疫检测仪(Thermo公司)450 nm检测各孔吸光度(OD)值，按以下公式计算：细胞增殖抑制率=(对照组OD-实验组OD)/对照组OD×100%，以浓度的对数与抑制率进行直线相关分析。

1.2.3流式细胞仪检测细胞周期的变化 取对数生长期细胞，以1×105个/mL接种于直径60 mm的培养皿中，24 h贴壁后弃去培养液，按实验分组加入含不同浓度药物的培养液。加药作用24 h后收集细胞，按照细胞周期检测试剂盒(凯基生物)使用说明进行操作，PBS离心洗涤后加入预冷的70%乙醇4 ℃固定过夜。然后PBS离心洗涤并收集细胞，重悬于PBS，加入100 μL RNase-A于37 ℃水浴消化30 min后加入400 μL 碘化丙啶(PI)混匀，室温避光染色30 min后流式细胞仪(美国BD公司)检测并分析细胞周期，计算细胞增殖指数。增殖指数=(S期百分比+G2/M期百分比)/(G0/G1期百分比)。

1.2.4Transwell实验检测细胞的侵袭能力 取对数生长期细胞，用无血清的培养基制成单细胞悬液，使细胞浓度为1×105个/mL。加200 μL细胞悬液至铺好Matrigel胶的Transwell小室中，将Transwell小室放入24孔板中，下室加入含15%胎牛血清的RPMI-1640培养液600 μL，每组设置2个复孔。培养24 h后取出Transwell小室，用棉签轻轻擦去小室微孔膜上层细胞后PBS冲洗2遍，4%多聚甲醛室温下固定20 min后PBS冲洗2遍，1%结晶紫染色30 min，蒸馏水冲洗。倒置显微镜下对穿至微孔膜下层的细胞计数。每份标本选取5个视野计数细胞个数，取平均值。

2 结 果

2.1药物对肺癌细胞增殖抑制率的影响 各组单药作用肺癌细胞，随着给药浓度的增加，时间的延长，对细胞的生长抑制作用也逐渐增加，呈现明显的时间剂量依赖效应。选择每个铂类药物最接近半数抑制浓度的药物剂量(IC50)分别与低剂量(20 ng/mL)1,25(OH)2D3联合作用于细胞，对肿瘤细胞的增殖抑制作用增强，与对应的铂类单药比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2药物对肺癌细胞周期的影响 与对照组比较，DDP组、CBP组、NDP组和1,25(OH)2D3组的G0/G1期的细胞比例都有增加；DDP组、CBP组、NDP组S期细胞比例降低；CBP组、NDP组G2/M期细胞比例增加。与对应的铂类单药组比较，DDP+1,25(OH)2D3联合组的G0/G1期的细胞比例升高,G2/M的细胞比例明显降低(均P<0.05)；CBP+1,25(OH)2D3联合组的G0/G1期的细胞比例升高,S期的细胞比例有所增加，G2/M的细胞比例明显降低(均P<0.05)；NDP+1,25(OH)2D3联合组的G0/G1期的细胞比例升高(P<0.05),S期的细胞比例明显降低(P<0.05)，G2/M的细胞比例变化不明显(P>0.05)，见表2。

表1 各组药物对肺癌细胞增殖的影响

a：P<0.05，与4 μg/mL DDP比较;b：P<0.05，与50 μg/mL CBP比较;c：P<0.05，与4 μg/mL NDP比较

表2 各组药物对肺癌细胞周期的影响

续表2 各组药物对肺癌细胞周期的影响

a:P<0.05，与对应的铂类药物组比较

2.3药物对肺癌细胞的侵袭影响 Transwell实验结果发现，与对应的铂类单药组比较,肺癌细胞经DDP、CBP、NDP与1,25(OH)2D3联合作用处理24 h后，肿瘤细胞的侵袭能力呈现不同程度的下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

A:对照组；B:DDP组；C:CBP组；D:NDP组；E:1,25(OH)2D3组；F:DDP+1，25(OH)2D3组；G:CBP+1,25(OH)2D3组；H：NDP+1,25(OH)2D3组；a:P<0.05，与对应铂类单药组比较

3 讨 论

原发性肺癌是我国主要恶性肿瘤之一,大多数肺癌患者被发现时已经属于中晚期，不能接受手术治疗，采用化疗的方式是目前治疗NSCLC患者的主要治疗方式。铂类化疗药物联合第3代化疗药物的双药化疗方案可进一步提高临床疗效，其总缓解率可达50%，中位生存时间达14.2个月，1年生存率提高到54%。DDP作为临床常用的化疗药物之一，主要通过调控肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡达到抗肿瘤效果[5-6]，但其存在消化道反应、肾毒性、骨髓抑制等不良反应[7-8]。其疗效与剂量呈正比，不良反应也与剂量相关，故临床工作中常因不良反应而限制其用量。维生素D为固醇类衍生物,吸收的维生素D运到肝脏中，在微粒体中经单氧酶系统作用，将其25位羟基化形成[1α,25(OH)D3]，[1α,25(OH)D3]在肾线粒体单氧酶作用下经羧基化，转变为1,25(OH)2D3，其为维生素D的主要生物作用形式。近年来一些体内外的实验研究证实，维生素D具有抑制肿瘤增殖、促进凋亡、抑制分化的作用，POURGHOLAMI等[9]在小鼠体外实验中，发现Hep-3B、PLC/PRF/5、SKHEP-1细胞的增殖被1,25(OH)2D3明显抑制，体内实验中不同剂量1,25(OH)2D3能够显著抑制裸鼠的SKHEP-1肿瘤生长。CAPUTO等[10]通过实验证实，1,25(OH)2D3对人肝癌细胞系HepG2的抑制作用是发生在细胞周期的G0/G1期，G0/G1细胞比例随1,25(OH)2D3浓度的增加而增加，并伴有S期细胞数量的减少。余晓燕等[11]通过检测患者血清中25羟维生素D[25(OH)D]和维生素D结合蛋白的浓度，分析其与患者临床病理特征及预后的关系发现，血清中维生素D和维生素D结合蛋白浓度高低在NSCLC的发生、发展过程中具有重要意义，两者可作为NSCLC患者预后评估的辅助指标。 SABZICHI等[12]用载有维生素D的纳米结构脂质体(NLC)与多柔比星(Dox)同时给药乳腺癌细胞MCF-7,结果细胞增殖百分比从(49.0±7.2)%降低至(37.0±5.1)%，细胞凋亡百分比增加两倍(P<0.05)。 在本实验中，结果显示DDP、CBP、NDP和1,25(OH)2D3单独使用对恶性胸腔积液中分离的肺癌细胞生长具有抑制作用，各铂类药物与1,25(OH)2D3联合应用时，抑制率明显高于铂类单药，并且具有时间浓度依赖性的特点。通过流式细胞仪检测细胞周期发现，3个铂类药物和1,25(OH)2D3联合作用时G0/G1期细胞比例增加，抑制细胞进入DNA合成期和有丝分裂期，两者联合应用能够抑制细胞增殖。Transwell实验结果显示，联合处理后，发生侵袭的肺癌细胞数量显著减少。

综上所述，本实验通过选择NSCLC晚期患者的胸腔积液中原代细胞作为实验肿瘤细胞，结果表明DDP、CBP、NDP联合1,25(OH)2D3作用可抑制肺癌细胞的增殖、侵袭能力，诱导细胞凋亡，1,25(OH)2D3能够增强铂类药物的化疗敏感度，减少单独大剂量使用铂类药物的不良反应，为肺癌的综合治疗提供更多依据。