不同剂量瑞舒伐他汀对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡及caspase-3的影响*

谢亚芹，李秀芬，赵 娟△，崔海鹏，李 颖，刘 凯

(1.承德医学院病理生理学教研室，河北承德 067000；2.承德医学院附属医院妇科，河北承德 067000)

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)是急性心肌梗死致死、致残的主要病因，因此减轻MIRI是一种治疗缺血性心脏病的重要手段。瑞舒伐他汀在降低血脂、改善动脉粥样硬化同时具有抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡及调节免疫反应等功能[1-2]。然而其对MIRI的保护作用是否呈剂量依赖性，需进一步研究。本研究通过观察不同剂量瑞舒伐他汀预处理对MIRI大鼠心肌细胞的超微结构及心肌细胞凋亡的影响，进一步探讨瑞舒伐他汀对于MIRI的保护作用。

1 材料与方法

1.1药品与试剂 瑞舒伐他汀(10 mg)购自阿斯利康制药有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)兔抗多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；SP免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司；PCR引物由上海生工生物工程技术公司合成。

1.2实验动物 健康成年清洁级雄性Wistar大鼠40只，体质量(220±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK(京)-2016-0011，生产合格证11400700127208。

1.3方法

1.3.1动物分组及MIRI模型建立 将40只大鼠适应性喂养1周后，分为假手术(Sham)组、MIRI组、MIRI+瑞舒伐他汀低剂量(MIRI+Ros-L)组、MIRI+瑞舒伐他汀高剂量(MIRI+Ros-H)组，每组10只。MIRI+Ros-L组、MIRI+Ros-H组于造模前第7天开始，分别每天空腹给予瑞舒伐他汀5、20 mg/kg(生理盐水溶解)灌胃1次，Sham组及MIRI组给予同体积生理盐水。采用结扎冠状动脉左前降支的方式建立MIRI模型。2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，连接小动物呼吸机辅助通气，连接心电图记录Ⅱ导联心电图。沿胸骨左缘开胸，暴露心脏，在左心耳下2～3 mm处用穿有圆形空心塑料套管的医用缝线结扎，使套管压迫动脉造成冠状动脉血流阻断。血流阻断成功的标准：以阻断的动脉远端心肌出现苍白，心电图ST段抬高作为冠状动脉血流阻断成功的判断标准。心肌缺血30 min后，将结扎线剪开，再灌注120 min，再灌注中观察心脏表面颜色转红，ST段下降为再灌注成功。Sham组只穿线不结扎冠状动脉。

1.3.2血流动力学测定 采用BL-420多媒体生物信号记录仪进行血流动力学测定，再灌注后经右颈总动脉逆行插管至左心室，记录血流动力学参数包括左心室舒张末压(LVEDP)，左心室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)等。

1.3.3心肌组织超微结构的观察 再灌注结束后，迅速剪下心脏，取1 mm3大小的左心室心肌数块经10%锇酸溶液固定后，按电镜常规技术进行脱水、包埋处理，采用乙酸钠与枸橼酸铅进行双重染色，在透射电镜下观察心肌细胞超微结构的改变。

1.3.4免疫组织化学法检测caspase-3蛋白的表达 按照试剂盒操作说明书采用免疫组织化学法进行检测。Ⅰ抗caspase-3多克隆抗体稀释浓度为1∶100。采用MiVnt图像分析系统在200倍显微镜下对免疫阳性结果进行半定量分析，以免疫阳性产物面积与视野面积的比值表示该抗原的相对表达水平。每只动物任选3张切片，每张切片选取4个视野，取平均值。

1.3.5RT-PCR法检测caspase-3 mRNA水平 caspase-3上游引物5′-TCC ACG AGC AGA GTC AAA-3′，下游引物5′-TTC AAC AAG CCA ACC AAG-3′(扩增产物208 bp)；β-肌动蛋白(β-actin)上游引物5′-GAG AGG GAA ATC GTG CG-3′，下游引物5′-CAT CTG CTG GAA GGT GGA CA-3′(扩增产物452 bp)。取大鼠缺血处心肌组织100 mg，按照说明书提取组织总RNA进行反转录。PCR扩增后进行电泳。采用Quantity One-v4.6.2软件对结果进行分析。

2 结 果

2.1各组大鼠血流动力学参数的比较 与Sham组比较，MIRI组大鼠LVEDP明显升高，±dp/dtmax明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与MIRI组比较，MIRI+Ros-L组、MIRI+Ros-H组大鼠LVEDP明显下降，±dp/dtmax明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)，MIRI+Ros-H组以上变化较MIRI+Ros-L组更明显，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2各组大鼠心肌细胞的超微结构的比较 Sham组心肌纤维排列整齐，肌小节结构完整，线粒体膜连续完整，线粒体嵴呈平行排列。MIRI组心肌细胞出现明显肿胀，肌膜出现断裂甚至缺损，肌丝出现断裂或溶解，线粒体肿胀、部分膜破裂，有部分线粒体嵴出现溶解、消失，甚至呈现空泡化，细胞核肿胀，染色质边集、凝聚。MIRI+Ros-L组和MIRI+Ros-H组心肌细胞损伤较MIRI组减轻，肌纤维略显规则，心肌线粒体形态结构改变较MIRI组明显减轻。与MIRI+Ros-L组比较，MIRI+Ros-H组线粒体肿胀及心肌细胞的损伤减轻更明显，见图1。

2.3各组大鼠心肌组织caspase-3蛋白表达的比较 caspase-3免疫阳性产物为棕黄色细颗粒物，沉积于心肌细胞质中。与Sham组比较，MIRI组大鼠心肌组织caspase-3蛋白表达明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与MIRI组比较，MIRI+Ros-L组、MIRI+Ros-H组大鼠心肌组织caspase-3蛋白表达出现降低(P<0.05)，其中MIRI+Ros-H组降低更为明显，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2、表2。

表1 各组大鼠血流动力学参数比较

a：P<0.05，与Sham组比较；b：P<0.05，与MIRI组比较；c：P<0.05，与MIRI+Ros-L组比较

A：Sham组;B：MIRI组;C：MIRI+Ros-L组;D：MIRI+Ros-H组

表2 各组大鼠左心室心肌组织caspase-3蛋白及mRNA的表达

a：P<0.05，与Sham组比较；b：P<0.05，与MIRI组比较；c：P<0.05，与MIRI+Ros-L组比较

1：Sham组；2：MIRI组；3：MIRI+Ros-L组；4：MIRI+Ros-H组

2.4各组大鼠心肌组织caspase-3 mRNA表达的比较 与Sham组比较，MIRI组大鼠心肌组织caspase-3 mRNA表达明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与MIRI组比较，MIRI+Ros-L组、MIRI+Ros-H组caspase-3 mRNA表达出现减少(P<0.05)，其中MIRI+Ros-H组减少更为明显，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3、表2。

3 讨 论

近年来研究表明，MIRI引起的心肌损伤是一个多途径、多信号通路参与的复杂病理过程，其中心肌细胞过氧化造成大量氧自由基的堆积，心肌细胞的凋亡及自噬、钙超载、能量代谢障碍等病理过程均造成心肌进一步的损伤[3-5]。其中心肌细胞凋亡是心肌组织学损害的最终发病环节，是导致心肌纤维化、心室重塑、心律失常及心力衰竭发生的重要因素[6-7]。因此，能否有效地减少心肌细胞的凋亡是衡量MIRI预后的关键。本研究通过透射电镜观察大鼠出现MIRI后心肌细胞的超微结构，发现MIRI组心肌细胞出现线粒体的损伤，细胞核的肿胀等细胞凋亡的迹象。通过血流动力学检测发现心肌再灌注后大鼠心室功能出现了恶化，提示MIRI后出现的心肌细胞的凋亡可能是导致心室功能下降的重要因素之一。

心肌细胞凋亡是一种受基因调控的主动的程序化的细胞死亡方式，是由caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程，其中caspase-3是凋亡过程中的关键执行蛋白[8]。细胞凋亡发生时，促凋亡基因释放增加，促进细胞色素C进入线粒体激活caspase-9，进而活化caspase-3，活化的caspase-3可通过激活核因子、DNA裂解酶等途径引起细胞内多种蛋白酶复合体破坏，最终诱导细胞凋亡的发生[9-10]，因此减少caspase-3的表达对于抑制缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡，改善心室功能具有重要意义。

瑞舒伐他汀可通过抑制甲基戊酸的生成，进而抑制胆固醇的合成，达到降低血脂的作用[11-12]。近年来大量研究表明，他汀类药物在降低血脂的同时还具有抗氧化、抗炎性因子等作用[13]，能够保护血管内皮，减少心脑血管事件的发生[14-15]。本研究表明，瑞舒伐他汀能够明显抑制大鼠MIRI过程中出现的心肌细胞凋亡，并且其剂量增加，抑制作用愈发显著。同时通过对细胞凋亡关键基因caspase-3蛋白和mRNA进行检测，发现瑞舒伐他汀能够明显抑制caspase-3的表达，并且其抑制作用与用药剂量有关。因此，在对缺血性心脏疾病进行血流再灌注之前，使用高剂量瑞舒伐他汀预处理可更有效抑制MIRI引起的心肌细胞凋亡，发挥心肌的保护作用。