化瘀方抗大鼠心肌纤维化疗效及其与氧化应激的关系

刘 馨，陈 凯，隋育坤，张宇彬，管怡晴，张国华△

(南方医科大学：1.中医药学院；2.药学院，广州 510515)

心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)是指心肌间质胶原纤维过度沉积，导致心力衰竭和心室肥厚[1-2]。氧化应激是由于体内抗氧化酶和氧自由基失衡，其在MF的发生过程中起着重要作用[3]。本课题组前期已证实血府逐瘀汤抗MF疗效显著[4]，但血府逐瘀汤成分复杂，具体作用机制尚不清楚。拆方研究是中医复方研究的传统手段，其通过精简复方，观察疗效变化，从而寻找最有效的配伍组合[5]。因此，本研究以精简组方但不降低疗效为目的，对血府逐瘀汤进行拆方研究，预测化瘀方可能是血府逐瘀汤抗MF的有效药物组合，对其进行实验验证，并研究其与氧化应激的关系，现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物 30只12周龄的自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)和5只同龄雄性Wistar-Kyoto(WKY)大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，编号：SCXK2016-0011)。

1.2药品及仪器 血府逐瘀汤组方免煎颗粒、化瘀方组方免煎颗粒及卡托普利均购自南方医科大学附属南方医院。彩色多普勒超声诊断仪(S40，深圳开立科技有限公司)；无创尾压仪(ALC-NIBP，上海奥尔科特生物科技有限公司)；倒置光学显微镜(BS-51，日本奥林巴斯公司)。

1.3方法

1.3.1网络药理学分析 网络药理学是新起的中药复方的研究方法[6]，它基于系统生物学理论，对生物系统进行网络分析的新学科[7]。BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/BATMAN-TCM)是首个用于网络药理学分析的中医分子机制研究工具。根据中医病理机制，血府逐瘀汤分为4个独立方，(1)化瘀方：桃仁、红花、川芎、赤芍、牛膝；(2)行气方：枳壳、桔梗、柴胡；(3)养血方：当归、生地；(4)调和方：甘草。BATMAN-TCM中拼音输入4个独立方的草药名。设置参数：预测候选靶点数不低于20；调整P<0.05。分别构建其“活性成分-靶点-疾病”网络图。发现与行气方、养血方和调和方比较，化瘀方网络图的节点和连接最多，数据分析显示化瘀方可用于治疗高血压、心力衰竭、心血管疾病等。结合中医理论和网络药理学，预测化瘀方可能为血府逐瘀汤抗心肌纤维化的有效药物组合。

1.3.2分组 SHR分为6组：模型组、化瘀方低剂量组(2 g/kg)、化瘀方中剂量组(4 g/kg)、化瘀方高剂量组(8 g/kg)、血府逐瘀汤组(16 g/kg)和卡托普利组(13.5 mg/kg),每组5只。5只WKY作为正常对照组。除正常对照组和模型组分别给予等量蒸馏水外，各组大鼠均灌胃给药，连续给药12周。

1.3.3超声心动图检测 多普勒超声仪检查大鼠心脏功能。2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后胸部备皮，M型模式下获得左心室长轴视图的稳定图像，观察并计算射血分数和短轴缩短率，其为评价心功能的敏感指标，下降则提示心力衰竭[8]。

1.3.4无创尾压仪检测 尾套法对大鼠进行尾动脉测量。老鼠置于装有保温垫(温度为37～38 ℃)的大鼠固定器中，将鼠尾置于加压套内，大鼠安静稳定2～3 min后仪器显示出稳定的脉搏波，按下开始键开始自动测量。

1.3.5生化指标检测 末次给药后，大鼠腹主动脉取血，静置离心后取上清液。按生化试剂盒说明书检测血清中心肌标志物：肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶MB (CK-MB)和乳酸脱氢酶 (LDH),其为心肌坏死的特异标记物[9]。准确称取心肌组织，加生理盐水机械匀浆，离心取上清液。先BCA比色法测量蛋白浓度，然后按生化试剂盒说明书检测氧化指标：过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)。

1.3.6苏木精-伊红(HE)染色和Masson染色 心肌组织4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片后，进行HE染色和Masson染色，于显微镜下随机视野拍照观察。

1.3.7反转录PCR(qRT-PCR) 提取心肌组织中总RNA，检测样品浓度及纯度。根据反转录反应体系反转为cDNA，配制qRT-PCR反应液，设定qRT-PCR反应条件，定量分析反应模板，根据2-△△Ct法计算CAT、GPx和SOD的mRNA水平。

1.3.8Western blot法 提取心脏组织蛋白，BCA比色法测量蛋白水平，定量后样品煮沸5 min，上样后置于电泳缓冲液中电泳，分离目的蛋白(CAT、GPx和SOD)，100 V电压转膜90 min，5%牛奶室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，二抗室温孵育1 h，TBST洗膜，ECL显色，曝光扫描。

2 结 果

2.1心血管指标和血流动力学参数检测 与正常对照组比较，模型组的射血分数和短轴缩短率显著降低(P<0.05)，收缩压、舒张压和平均动脉压显著升高(P<0.05)，化瘀方治疗后能显著增加射血分数和短轴缩短率(P<0.05)，降低收缩压、舒张压和平均动脉压(P<0.05)，高剂量化瘀方的降压效果与血府逐瘀汤相当，见表1。

2.3心肌标记物检测 与正常对照组比较，模型组的CK和CK-MB均显著升高(P<0.05)。化瘀方治疗后CK和CK-MB较模型组显著降低(P<0.05)，化瘀方高剂量组治疗效果优于血府逐瘀汤组(P<0.05)，LDH各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

a：P<0.05，与正常对照组比较；b：P<0.05，与模型组比较

2.3HE染色和Masson染色 HE染色结果显示：模型组的心肌细胞排列紊乱，出现大量炎性细胞，并发生浸润。化瘀方低、中、高剂量组炎性细胞减少，炎性细胞浸润程度减轻，化瘀方能有效减轻心肌病理改变。Masson染色结果显示：与正常对照组比较，模型组的心肌胶原纤维显著增多，排列紊乱。化瘀方低、中、高剂量组的心肌纤维排列有序，心肌中胶原纤维减少，见图2、3。

2.4抗氧化酶检测 模型组血清及心肌组织中CAT和GPx显著低于正常对照组(P<0.05)，化瘀方高剂量治疗后能显著增加CAT和GPx的表达(P<0.05)。各组血清及心肌组织中SOD比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组比较，CAT和GPx mRNA表达降低(P<0.05),化瘀方治疗后增加了CAT和GPx mRNA表达(P<0.05)。各组SOD mRNA表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2、图4。

表1 各组射血分数、短轴缩短率、收缩压、舒张压、平均动脉压和心率的比较

a:P<0.05，与正常对照组比较；b：P<0.05，与模型组比较

A:正常对照组；B：模型组；C：化瘀方低剂量组；D：化瘀方中剂量组；E：化瘀方高剂量组；F：血府逐瘀汤组；G：卡托普利组

表2 各组血清及心肌组织中CAT、GPx和SOD水平比较

a:P<0.05，与正常对照组比较；b：P<0.05，与模型组比较

A:CAT；B:GPx；C:SOD;a：P<0.05，与正常对照组比较；b：P<0.05，与模型组比较

3 讨 论

心肌纤维化发病过程中，高血压是致心室重构的一个重要原因[10]。氧化应激与高血压的发生、发展存在因果关系。氧化应激既引起血管壁增厚和血管腔狭窄，又损伤内皮细胞，导致内皮功能障碍，血管舒张性降低，增加血管收缩，引起外周血管阻力增加和血压升高[11]。CAT、GPx和SOD是抗氧化应激的一线防御酶[12]，高血压引起的心肌纤维化与抗氧化酶减少密切相关[13-14]。因此，评价心肌氧化应激程度有助于研究药物的药效及探究其病理机制。

结合中医理论和临床实际，血瘀脉阻是导致心肌纤维化发生的主要原因[15]。因此对于心肌纤维化的治疗，关键在于改善体内瘀血。大量研究表明，具有化瘀功效的复方可以治疗心肌纤维化，如扶正化瘀胶囊[16]、益气化瘀汤[17]等。本研究团队亦验证了具有活血化瘀作用的血府逐瘀汤具有抗心肌纤维化的作用[4]。基于以上发现，本研究推测，在抗心肌纤维化方面，化瘀方是血府逐瘀汤发挥作用的有效药物组合。BATMAN-TCM分析结果也与笔者的猜想相符。血府逐瘀汤成分复杂，不利于深入研究其具体药理作用及潜在的作用机制。因此，笔者对11味药物组合的血府逐瘀汤进行拆方研究，预测5味药物组合的化瘀方是血府逐瘀汤抗心肌纤维化的有效药物组合。

选材方面，SHR是1963年培育成功的高血压模型大鼠，4周龄后，其血压逐渐增高，10周龄后开始出现心功能下降，导致心肌纤维化[18]。目前已广泛用于研究高血压疾病，WKY常作为SHR的正常对照组[19-20]。因此，本研究选取12周龄的SHR，模拟人体高血压情况。本研究中，模型组的血压、CK和CK-MB增加，射血分数和短轴缩短率降低，胶原纤维显著增多。化瘀方治疗后能逆转这些指标，减少纤维增生。随着化瘀方浓度的增高，其抗心脏损害效果越好，化瘀方高剂量组疗效不劣于血府逐瘀汤。化瘀方能显著逆转心肌纤维化，这种作用可能与降压和改善心功能有关。另外，本研究通过观察抗氧化酶的活性，评价大鼠体内氧化应激的变化。发现化瘀方治疗增加了CAT和GPx活性，并增加了CAT和GPx的mRNA和蛋白的表达。这说明化瘀方可能通过减轻氧化应激反应，从而调节心脏收缩功能和血压，对心肌纤维化起治疗作用。

综上，在抗心肌纤维化方面，化瘀方是血府逐瘀汤发挥作用的有效药物组合，其作用可能与减轻氧化应激有关。化瘀方由5味中药组成，组方更加精简，并且其药效不劣于全方，有利于以抽丝剥茧的方式深入开展药理研究及机制研究。然而，化瘀方的具体作用靶点及潜在机制目前尚不清楚，仍需进一步深入探索。