基于D-S证据理论的数学模型优化补阳还五汤中多目标有效成分提取工艺*

冯 琛万嘉洋姚 玥张 涵陈天翔 丁志山 李晓红 虞 立 刘 佳 金伟锋△

（1.浙江中医药大学第二临床医学院，浙江 杭州 310053；2.浙江中医药大学医学技术学院，浙江 杭州 310053；3.浙江中医药大学第三临床医学院，浙江 杭州 310053；4.浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 310053；5.浙江中医药大学生命科学学院，浙江 杭州 310053）

补阳还五汤是清代医学名家王清任所著，是中医典籍《医林改错》所载的经典名方［1］。补阳还五汤对缺血性中风气虚血瘀证的治疗已取得共识，位居中医益气活血类代表方之首［2-3］。许多学者开展了大量的补阳还五汤临床应用、作用机制及药效物质基础等系列研究，结果表明补阳还五汤治疗缺血性中风具有较好疗效，且用药安全［4-6］。然而中药复方乃至单味中药成分复杂，有效成分含量甚少，何况有效成分往往不是单一成分，补阳还五汤亦是如此。

研究表明，羟基红花黄色素A（HSYA）、阿魏酸、芒柄花素均是补阳还五汤中主要有效成分。HSYA是菊科植物红花Carthamus tinctoriusL.的干燥花中的主要有效成分［7］，具有抗心肌、脑缺血损伤［8］，抗脑血栓形成，抗肿瘤，调节脂代谢等药理作用。阿魏酸是伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根和伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根茎中的主要有效成分［7］，具有抗氧化、清除自由基以及细胞保护等药理作用［9］。芒柄花素是豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或 膜 荚 黄 芪Artragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根的主要有效成分［7，10］，具有抗氧化，抗心脑血管等药理作用［11］。

Dempster-Shafer（D-S）证据理论是一种研究不确定性问题的完整理论。它不仅能够强调事物的客观性，还能强调人对事物估计的主观性。D-S证据理论将互不相关的基本问题组成的完备集合，表示对这一问题的全部可能答案，即D-S证据理论模型的基本解题方法。其具有采用“区间估计”对不确定性信息进行描述，而非“点估计”，在区别不知道、不确定和精确反映数据收集方面显示出很大的灵活性等特点。现今D-S证据理论已在通信工程、航天航空、能源再生等领域广泛运用［12-14］。遗传算法（GA）是一种通过模拟生物自然进化和遗传过程，搜索局部乃至全局最优解的方法和计算模型，是当今人工智能领域中解决最优化问题的搜索启发式算法［15］。人工神经网络（ANN）是一种模仿高等生物大脑神经元结构和功能的数学或计算模型，其中误差反向传播算法（BPNN）模型是ANN中的一种监督式的学习模型［16］。将GA与BPNN相结合，可使数据在多层结构网络中的局部范围内自动训练、优化寻找最佳结果。但在当今人工智能大数据时代，将上述三者相结合的数学模型在中医药领域中还处于空白。

因此，本文采用D-S证据理论与GA-BPNN模型结合，对补阳还五汤中HSYA、阿魏酸、芒柄花素3种主要有效成分进行提取工艺优化、预测，得到最佳提取工艺，最后验证模型的准确性。

1 仪器与材料

梅特勒XS205电子天平，METTLER TOLEDO国际有限公司；CASCADA BIOMK2超纯水仪，美国PALL公司；HH系列数显恒温水浴锅，上海江星仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；Waters Alliance高效液相色谱仪（2695分离单元、2489紫外检测器、Waters Empower工作站），美国Waters公司。

HSYA对照品（批号SZ201702005QA，质量分数≥98%），芒柄花素对照品（批号20170503，质量分数≥98%），天津士兰科技有限公司，阿魏酸对照品（CAS：1135-24-6，质量分数≥98%）；黄芪 （甘肃，批号170901）、川芎（四川，批号 170901）、当归（甘肃，批号171101）、赤芍（内蒙古，批号 180501）、桃仁（陕西，批号 180401），红花（甘肃，批号 180401），地龙（广东，批号180301），均购于浙江中医药大学中药饮片有限公司，经浙江中医药大学药学院马永敏研究员鉴定，均符合2015年版《中国药典》相关规范要求。

软件为Matlab开发的中药材药物提取数据优选系统V2.0软件，D-S证据理论程序包。

2 方法与结果

2.1 HSYA、阿魏酸、芒柄花素的HPLC同时测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.2%磷酸水溶液，采用梯度洗脱程序：0～25 min，5%～18%乙腈；25～55 min，18～55%乙腈；55～70min，55～80%乙腈；70～80 min，80%乙腈； 流速 1.00 mL/min； 检测波长230 nm；柱温箱为25℃；进样量10 μL。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取HSYA、阿魏酸和芒柄花素对照品适量，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度线，充分摇匀，配成1 mg/mL的单一成分母液。分别精密吸取上述HSYA、阿魏酸对照品母液各2 mL，芒柄花素对照品母液1 mL，置于同一个10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度线，摇匀，得到混合对照品溶液（HSYA 0.20 mg/mL、阿魏酸 0.10 mg/mL、芒柄花素0.1 mg/mL）。

2.1.3 补阳还五汤复方溶液提取制备 按照补阳还五汤复方药材比例称取药材10 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入60%乙醇350 mL，称取质量，在80℃下热回流提取2 h，室温下冷却，补足减少的质量，摇匀，抽滤，得到提取药液。将药液旋转蒸发至近干，用适量甲醇溶解，转入50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，得到供试品溶液。

2.1.4 系统适应性试验 仪器分别自动进样混合对照品溶液、供试品溶液各 10 μL，按“2.1.1”项下方法测定。3种成分达到基线分离，分离度大于1.5，色谱图见图1。

图1 HPLC图

2.1.5 线性关系的考察 混合对照品溶液作为1号溶液，对混合对照品溶液进行倍比稀释，制成一系列质量浓度溶液，即2～6号溶液。按照“2.1.1”项下色谱条件测定物质峰面积，以对照品质量浓度为横坐标（X），对应的峰面积为纵坐标（Y），制作标准曲线，得到回归方程。HSYA：Y=5 946.87X-22.3486，R2=0.9995，在 0.02～0.20 mg/mL范围内具有较好线性关系；阿魏酸Y=50 458.12X-14.9545，R2=0.9989， 在 0.02～0.20 mg/mL 范围内具有较好线性关系；芒柄花素Y=57 127.25X+10.6913，R2=0.9991，在 0.002～0.10 mg/mL 范围内具有较好线性关系。

2.1.6 精密度试验 自动进样3号混合对照品溶液10 μL，按“2.1.1”项下条件重复进样 6次，记录混合对照品溶液中HSYA、阿魏酸和芒柄花素的色谱峰面积并计算RSD值分别为0.89%、0.43%、0.74%，表明精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 按照“2.1.3”项下方法制得供试品溶液 1 份，按“2.1.1”项下条件分别在 0、2、4、6、8、12、24 h进样，记录HSYA、阿魏酸和芒柄花素的色谱峰面积，供试品溶液色谱峰面积的RSD值分别为2.00%、1.88%、1.56%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.8 重复性试验 按补阳还五汤复方药材 （同一批次）的比例称取药材10 g，精密称取6份，按“2.1.3”项下方法制得供试品溶液，高效液相色谱法测定，记录HSYA、阿魏酸和芒柄花素的色谱峰面积，计算得其质量分数的RSD值分别为2.65%、1.33%、2.92%，表明该方法重复性良好。

2.1.9 回收率试验 按补阳还五汤复方药材 （已测定的同批次药材）的比例称取药材5 g，精密称定，共6份，按照“2.1.3”项下方法制备提取样品溶液，每份各精密加入HSYA对照品1 mg、阿魏酸对照品0.50 mg和芒柄花素对照品0.05 mg，制备供试品溶液，按照色谱条件进行测定，HSYA的平均回收率为108.57%，RSD为2.13%；阿魏酸的平均回收率为101.49%，RSD为1.84%；芒柄花素的平均回收率为98.98%，RSD为1.87%，说明该方法回收率良好。

2.2 响应面试验设计

2.2.1 因素水平设计 基于单因素试验的基础上，确定补阳还五汤复方中3种有效成分提取率的4个因素：提取时间（A）、乙醇体积分数（B）、提取温度（C）、液料比（D），最后进行四因素五水平的响应面试验设计，筛选最佳提取工艺。见表1。

2.2.2 试验方法 按补阳还五汤复方药材的比例称取药材8 g，共30份，按照响应面试验设计方法进行乙醇热回流提取，放冷，抽滤，旋转蒸发至尽干，用适量甲醇溶解，转入50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得到30个样品溶液，密封置于冰箱内备用。最后按照“2.1.3”项下方法测定HSYA、阿魏酸和芒柄花素的提取率。提取率＝各成分的量/生药材量，结果见表1。

2.3 D-S证据理论方法下的权重赋值

各个成分进行归一化处理，即各成分的每个数除以这组数之和。然后依据D-S证据理论程序包求得归一化常数K=0.0988，各成分相关系数：AHSYA=1/36 530，B阿魏酸=1/7 159.5，C芒柄花素=1/1 190.6。 最终得到权重赋值公式：综合评价值=1/0.0988×提取率HSYA/36 530×提取率阿魏酸/7 159.5×提取率芒柄花素/1190.6×100 000，结果见表1。

表1 响应面试验设计方案及结果（n=3）

2.4 RSM软件分析结果

采用Design-Expert.V8.0.6响应面软件对上述响应面方法提取后计算得到的综合评价值进行分析：模型的P值＜0.0001，提取时间的PA为0.2073，乙醇浓度的PB为 0.5893，提取温度的 PC为 0.0321，液料比的PD为0.0023，R2=0.9086。模型的方程为：综合评价值=-3 194.14+35.95×A+9.91×B+62.97×C+12.52×D+0.12×A×B-0.09×A×C+2.24×A×D-0.03×B ×C-0.07×B×D+0.12×C×D-19.10×A2-0.06×B2-0.34×C2-0.83×D2。 同时得到预测结果为：提取时间1.7 h，乙醇浓度53%，提取温度91℃，液料比14∶1，该条件下预测得到的综合评价值为66.75。

2.5 Matlab环境下的模型优化

本文采用Matlab开发的中药材药物提取数据优选系统V2.0软件，其中包含BPNN工具包 （newff）和GA工具箱，网络结构为3层（即输入层：提取时间、乙醇浓度、提取温度、液料比；中间层：隐层神经元个数；输出层：综合评价值），不断调整软件中的参数使之符合实验需要。将30组数据的第1～27组（共27组）作为神经网络模型的训练数据，第28～30组（共3组）作为评判神经网络模型优劣的验证数据，导入到神经网络（参数设置：现实频率为5，训练次数为100，训练目标最小误差为0.001，其余为默认值）中，结合GA工具箱（参数设置：种群规模为100，最大迭代次数为1 000，满意的适应值为0.0005，梯度下降为10～15，其余为默认值），不断调整神经元数量，对网络模型进行训练优化，得到拟合误差（%）、预测误差（%）、总体误差（%）、模型拟合率（R）等4个结果，见表4；实验数据和理论数据拟合结果见图2。

图2 实验数据和理论数据相关性分析结果

从表2可知，神经元个数从1～6，拟合误差由大变小后再变大，即出现了统计学中的过拟现象，当神经元为5时，结果都较其他神经元个数时好，其拟合误差为6.22%、预测误差为3.46%、总体误差为4.84%、模型拟合率R为0.9969；从图2可知，当神经元变化从1～5时，所有的数据愈来愈靠近对角斜线（相关性斜线）；当神经元为5时，所有数据基本与相关斜线重合；而神经元为6时，有些数据又开始逐渐偏离相关性斜线，这也恰好印证了模型优化参数在图中的变化过程。因此，本文选取神经元个数为5进行下一步数据预测。

表2 模型优化参数

2.6 模型的目标寻优

基于上述神经网络模型，本文进行实数编程，再次建立GA模型（参数设置：种群规模为100，最大迭代次数为1 000，满意的适应值为0.0005，梯度下降为10～15，其余为默认值），进行目标结果寻优。得到的结果如下：提取时间1.7 h，乙醇浓度50%，提取温度90℃，液料比16∶1，网络预测综合评价值为77.20。

2.7 验证试验

按上述得到的两种提取优化工艺条件，按复方比例称取80 g药材，共8份，进行乙醇热回流提取验证试验，测定各成分的提取率，结果见表3。由表3可知，RSM法实验平均综合评价值为70.82，其RSD为2.64%，预测值为66.75；GA-BPNN法下的实验平均综合评价值为76.47，其RSD为1.49%，预测值为77.20。上述验证试验显示，RSM法的预测值较GA-BPNN模型低，且低于30组实验中的第3组，故寻优结果较劣；RSM法的验证试验真实值也较差于遗传神经网络模型的，故D-S证据理论下的遗传神经网络模型优于响应面法，即本文最佳的提取工艺条件选择GA-BPNN模型所给出的结果，即提取时间1.7 h，乙醇浓度50%，提取温度90℃，液料比16∶1。

表3 两种方法最佳工艺下的验证试验

3 结 论

基于单因素实验的基础上，最终选取提取时间、乙醇浓度、提取温度、液料比4个因素，采用四因素五水平的响应面设计方法，进行乙醇热回流提取补阳还五汤中的HSYA、阿魏酸、芒柄花素3种成分，得到的提取率利用D-S证据理论方法得到综合评价值。利用RSM法和GA-BPNN模型同步对综合评价值进行最佳工艺优化和预测，验证结果发现：GA-BPNN模型得到的最佳提取工艺条件优于RSM法。

本文基于D-S证据理论数据处理方法，采用当前较为常用的RSM法和热门的GA-BPNN模型对中药复方补阳还五汤中的HSYA、阿魏酸、芒柄花素3种成分进行提取工艺优化和预测。结果发现GA-BPNN模型在中药有效成分多目标寻优中效果显著，简便快捷，这也为中药有效成分多目标寻优、发现其药效物质基础和实现现代化中药研究提供了新的思路和参考。