大肠杆菌微细胞工厂生产萜类化合物研究进展

王崇龙,曹智钦，覃小华，李郁梅，卫功元

(苏州大学 基础医学与生物科学学院， 江苏 苏州 215123)

萜类化合物(terpenoids)是自然界中种类庞大、结构复杂多样的天然产物,已鉴定的种类超过50 000 种。其中，许多种类具有特殊的生理功能或极高的经济价值,因而被开发利用,如用作抗肿瘤和消炎止痛的药物、高级香料、环保杀虫除草剂等[1]。现在，随着化石能源资源枯竭和人们环境变化的关注日益加强，研究人员积极寻求新能源以替代传统的化石能源。许多萜烯(烃)具有媲美汽油、重油和航空燃油的物理和化学特性，被认为是可直接替代传统化石燃料的新一代生物燃料。异戊二烯(isoprene)半萜更是可以直接用来生产天然橡胶的基质原料。因此，萜类化合物涉及医药、环境、农业和能源等领域，在人类健康生活和生产活动中发挥着重要作用。

然而，萜类化合物作为次生代谢产物，在天然原料(如植物体)中的含量极其有限。例如，抗疟药物青蒿素(artemisinin)的含量仅为青蒿(ArtemisiaannuaL.)叶片干质量的0.1%～1%[2]；1株100年树龄的红豆杉(Taxusbrevifolia)仅可提取约260 mg泰素，而治疗1个癌症病人约需要消耗2～4株此种珍稀植物[3-4]。因此，从天然原料中萃取分离萜类化合物的产量难以满足市场需求，使得供需关系失衡。此外，这种“杀鸡取卵式”的生产方式会消耗大量现存的珍稀生物资源，造成不可挽回的生态危机。直接化学合成法又因萜类化合物本身结构的复杂性，使得化学合成步骤非常繁琐，且得率极低。例如，泰素从头化学合成需要经过35～51个步骤，最高得率仅为0.4%[3]。如此低的产量不能满足社会对大宗原料物质(如生物能源等)的需求。模式微生物大肠杆菌(Escherichiacoli)具有生长周期短、遗传背景清晰、遗传操作简单成熟和易于扩大化培养等优点，同时，现在新技术(如亲和膜法)的发展使得有效去除内毒素技术日臻成熟。因此，开发大肠杆菌微细胞工厂，利用廉价的碳源或培养基生产此类具有高附加值和广泛用途的萜类化合物，被认为是一条可持续发展的替代途径，受到生物工程师的青睐[5-6]。

近年来，越来越多的萜类合成路径得以从植物、细菌和真菌等物种中解析，伴随着合成生物学(synthetic biology)和代谢工程(metabolic engineering)技术的发展[7-8]，在大肠杆菌中重构萜类合成通路和工程化改造取得了显著成效，极大地提高了萜类化合物的合成积累能力。这为进一步深入研究萜类化合物的生物合成和工业化生产奠定了良好基础。微生物工厂生产萜类，其产量主要依赖于寻找高效的萜类合成酶，增加前体物的合成供应，代谢通量的调节及细胞底盘的编辑等[9-10]。

本文中，笔者对基本结构单元异戊二烯焦磷酸(IPP)和其异构体双甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)主干合成途径(stem pathway)以及多样性萜类化合物的枝端合成途径(branch pathway)进行综述，总结近几年来搭建大肠杆菌微细胞工厂生产各类萜类化合物所采用的优化策略，展望合成生物学和代谢工程领域新兴技术的可能方向，为理性设计大肠杆菌微细胞工厂提供借鉴，推动最终实现萜类化合物的高效高产和工业化。

1 萜类化合物的合成途径解析

1.1 IPP和DMAPP基本结构单元的合成途径

尽管萜类化合物有着复杂多样的结构，它们均起始于2个五碳(C5)的基本结构单元IPP和DMAPP。自然界中存在2条主要的IPP/DMAPP合成途径(图 1)：2-甲基赤藓醇磷酸(MEP)途径，主要存在于原核生物及植物质体中；甲羟戊酸(MVA)途径，主要存在于真核生物和少量细菌中[11-12]。

图1 合成IPP和DMAPP前体的MEP通路和MVA通路及相关酶Fig.1 MEP and MVA pathways for precursor synthesis of IPP and DMAPP,and associated enzymes

在MEP途径中，5-磷酸脱氧木酮糖(DXP)合成酶(Dxs)利用焦磷酸硫胺素(TPP)作为辅因子，首先缩合糖酵解中间产物甘油醛-3-磷酸(G-3-P)和丙酮酸(pyruvate)生成 DXP；进而在NADPH存在的条件下，经DXP还原异构酶(Dxr)催化还原生成MEP(此合成途径也因而以该重要的中间产物命名)。此两步催化反应被认为是MEP途径中最为重要的限速反应。随后，在2-甲基赤藓醇磷酸胞苷酰基转移酶(IspD)的催化下，MEP与CTP相作用生成4-二磷酸胞苷酰-2-C-甲基-D-赤藻糖醇(CDP-ME)；CDP-ME激酶(IspE)利用ATP将CDP-ME磷酸化生成4-二磷酸胞苷酰-2-C-甲基-D-赤藻糖-2-磷酸(CDP-MEP)；CDP-MEP再经过2-C-甲基赤藓糖醇-2,4-环二磷酸(MEcPP)合成酶(IspF)的催化作用，裂解和环化生成MEcPP并释放出CMP。最后，MEcPP经(反)-4-羟基-3-甲基-2-丁烯焦磷酸(HMBPP) 合成酶(IspG)还原催化作用开环生成HMBPP，经HMBPP还原酶(IspH)对HMBPP进一步还原，按约1∶ 5的摩尔比生成DMAPP 和IPP。此外，IPP/DMAPP异构酶(IDI)可以催化实现2种异构体之间的转换。

在MVA途径中，3分子起始底物乙酰辅酶A(acetyl-CoA)在硫解酶(THL)和β-羟基-β-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)合成酶(HMGS)的催化下生成HMG-CoA,HMG-CoA还原酶(HMGR)在NAPDH存在的情况下催化还原HMG-CoA生成MVA。此还原步骤是一个不可逆反应和MVA合成的限速反应。接着，MVA在ATP存在的情况下被MVA激酶(MK)磷酸化其5′-OH位，生成甲羟戊酸-5-磷酸(MVA-5-P)，继续被MVA-5-P激酶(PMK)催化生成甲羟戊酸-5-焦磷酸(MVA-PP)，最后在MVA-PP脱羧酶(DPMD)作用下发生脱羧并双键化生成IPP。IPP/DMAPP异构酶IDI 催化IPP的异构生成DMAPP。该经典MVA途径中的酶系组成和各酶的功能研究已经比较透彻。然而，最近的研究表明某些古生菌(Archaea)中可能存在异于该经典MVA途径的合成旁路[13-14]。在沃氏嗜盐富饶菌(Haloferaxvolcanii)中，MVA-5-P可能先经过MVA-5-P脱羧酶(PMD)脱羧作用生成异戊二烯磷酸(IP)，再经过IP激酶(IPK)磷酸化生成IPP。在嗜酸热原体菌(Thermoplasmaacidophilum)中，MVA的磷酸化由甲羟戊酸3-激酶(M3K)催化，在MVA的3′位羟基发生磷酸化，生成甲羟戊酸3-磷酸(MVA-3-P),继续由甲羟戊酸-3-磷酸5-激酶(MVA-3-P 5-kinase)在其5′-OH位磷酸化生成甲羟戊酸-3,5-双磷酸(MVA-3,5-BP),最后经由MVA-5-P脱羧酶PMD和IP激酶催化生成IPP。

1.2 萜类化合物的枝端合成途径

主干途径显示为棕黄色，枝端途径显示为灰色，可分为各类萜烯母核分子合成(浅绿色)和多种母核修饰途径(浅蓝色)两层图2 萜类化合物生物合成路线示意Fig.2 Scheme of biosynthesis routs of terpenoids

基本结构单元DMAPP和IPP是所有萜类的共同前体。1分子DMAPP在相应异戊二烯焦磷酸合成酶的催化作用下，聚合不同分子数量的IPP形成香叶基焦磷酸(GPP)、法尼基焦磷酸(FPP)和香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)等。接着，这些焦磷酸中间体再经过不同的萜类合成酶(TPS)催化发生脱磷、环化和羟化反应,生成结构各异的萜类烯烃(olefins)和烯烃醇(图2)。依据所含C5基本结构单元的数量，划分为半萜烯(hemiterpenes,C5)、单萜烯(monoterpenes,C10)、倍半萜烯(sesquiterpenes,C15)和双萜烯(diterpenes,C20)。另外，2分子FPP以头对头的方式经鲨烯合成酶(SQS)催化合成鲨烯(C30)；也可以经脱水鲨烯合成酶(DSQS)合成脱水鲨烯，再经脱水鲨烯去饱和酶(DSQD)合成4,4′-四神经孢子(4,4′-diaponeurosporene,C30)——C30类胡萝卜素类(C30 carotenoids)化合物的前体。同样，2分子GGPP以相同的方式经八氢番茄红素合成酶(PHS)催化合成八氢番茄红素，再经八氢番茄红素去饱和酶(DSQD)生成番茄红素(lycopene,C40)——C40类胡萝卜素类化合物和维甲类物质(retenoids，C20)的前体。以这些酶构建萜类化合物的枝端合成途径可以合成各类在结构层面多样的萜类化合物骨架母核(图2)。进而，这些母核分子还可以经过羟基化、环氧化、糖基化和卤化等多种修饰作用，形成种类更加丰富的、生物活性趋向更加多样化的各类物质。氧化是萜类化合物修饰中最常见的方式，多数情况下通过细胞色素P450氧化酶系(CYPs)进行单加氧反应[15]。例如，柠檬烯(limonene)由柠檬烯-6-羟化酶催化在6位发生催化生成香芹醇(carveol)；黄花蒿CYP71AV1能催化紫穗槐二烯(amorphadiene)到青蒿酸(artenisinic acid)的多步氧化；鲨烯能在鲨烯环氧酶(squanlene epoxidase)的催化下生成环氧鲨烯(2,3-oxidosqualene)。

2 大肠杆菌代谢工程合成萜类化合物

2.1 MEP通路的代谢工程

大肠杆菌利用其固有MEP途径合成IPP和DMAPP 2种基本结构单元。该内源通路可能在转录、翻译及翻译后多个水平进行严格调控[16]，然而其调控机制尚未完全阐明。MEP通路的8个基因(包括idi)分散在基因组的7个不同座位。最普遍的调控策略是通过MEP通路限速酶(如Dxs、Dxr和Idi等)的过表达以提高前体物IPP和DMAPP的合成。例如，通过表达并优化Dxs、Dxr和Idi这3个酶在载体上的表达顺序，将异戊二烯绝对生产强度从0.47 mg/(g·h)(以1克细胞干质量计)提高到2.73 mg/(g·h)[17]。将Dxs、Idi、IspD和IspF这4个酶模块化，通过启动子及拷贝数的改变调控MEP通路，同时结合调控紫杉二烯合成模块的表达优化，该紫杉醇前体物的产率近1.0 g/L[3]。与利用载体过表达限速酶相比，研究者们也尝试了直接调控大肠杆菌内源限速酶的表达。通过无痕编辑dxs和idi基因与启动子间的核糖体结合区(RBS)，β-胡萝卜素工程菌株产β-胡萝卜素的产率提升了2.5倍，从1.53 mg/g提升到5.33 mg/g(以1 g细胞干质量计)。进一步加强β-胡萝卜素模块的表达，调节限速酶Dxr和Idi,强化表达水平,提升IPP和DMAPP合成前体的能力，最终β-胡萝卜素产率达到18.4 mg/g[18]。

MEP通路利用糖酵解途径中的G-3-P和丙酮酸为底物，并按1∶ 1的摩尔比起始合成，而2种底物在大肠杆菌代谢网络中的浓度与此要求有较大差异。早期的研究表明，通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Ppc)或者合成酶(Pps)过表达使得代谢流从丙酮酸向G-3-P逆向，此策略平衡了MEP通路2个起始底物的比例，将工程菌产番茄红素的量提高了3～5倍[19]。最近的研究将底物的来源途径从糖酵解途径转换为Entner-Doudoroff(ED)途径和戊糖磷酸(PPP)途径，使得工程菌利用MEP途径合成萜类的效率呈数倍提高[20-21]。

MEP通路的激活还需要辅因子ATP和NADPH的参与。合适的NADPH氧化还原状态和浓度是维持Dxr、IspG和IspH活性，提高MEP通路合成效率的重要保障。过表达黄素氧还蛋白(FldA)及其还原酶(Fpr)和NAD激酶使得工程菌通过MEP通路合成原伊鲁烯(protoilludene)的产量提升6.6倍，从67.4 mg/L升至512.7 mg/L[22]。

MEP通路复杂，其调控体系尚不明晰，而代谢工程的改造需要精确地控制各酶组分的表达，以避免代谢中间产物(如MEcPP)的累积[23-24]。例如，通过平衡IspG和IspH的表达水平，MEcPP的累积得以消除，改造后的工程菌株合成β-胡萝卜素和番茄红素的能力提升了70%以上[25]。此外，研究者们尝试以D-阿拉伯糖为碳源，利用果糖-6-磷酸醛缩酶对糖底物的广谱活性来合成DXP，为MEP通路提供新的底物[26]。随着对MEP通路调控理解的加深，通过此通路合成萜类化合物一定会获得更大的进步。

2.2 MVA通路的代谢工程

异源表达MVA通路是一条被广泛接受的策略，通过促进IPP和DMAPP的供给，从而在大肠杆菌中提升萜类产量。伯克利大学杰伊·凯斯林(Jay Keasling)研究组首先将此通路引入大肠杆菌中来提升青蒿素前体紫穗槐二烯(amorphadiene)的产量[27]，为很多研究组通过编辑此通路在大肠杆菌中合成多种萜类物质提供了范例。通过RBS起始蛋白质的翻译强度，优化MVA通路各组分的表达水平，使得紫穗槐二烯产量达到3.6 g/L的水平。还有以变更启动子、载体拷贝数及同源基因替换的策略来调节MVA通路合成IPP和DMAPP，成功获得多种萜类产物[28-30]。然而，MVA通路的过于上调或者萜类产物合成与IPP和DMAPP供给的失调，往往会造成IPP/DMAPP及其他焦磷酸中间产物的累积，产生细胞毒性，影响到工程菌合成萜类产物的能力。与这些静态调控策略相比，研究者们也发明出了一些巧妙的策略来动态调控MVA通路合成IPP和DMAPP[31]。例如，法尼基焦磷酸(FPP)应答型启动子可以敏锐地反馈细胞内FPP的浓度水平，从而调节FPP的合成水平，并使之向紫穗槐二烯转化，这使得产物的产量比静态调控的产量翻番，摇瓶培养达到1.2 g/L的水平[32]；相同的策略使得工程菌产β-胡萝卜素达到23 mg/g的水平[33]。通过群集效应系统感知种群密度来控制整个合成通路的表达水平，促使工程菌能合成1.1 g/L红没药烯[34]。

MVA通路的调节具有更强的鲁棒性，虽然调控的精度较低，但是对底盘细胞的适应性比MEP通路要强。通过补料分批培养，红没药醇产量达到了9.1 g/L[35]；结合通气回收，补料分批培养异戊二烯的产量可达到60 g/L[36]。

MVA通路的一些旁路途径的发现可以丰富MVA通路的代谢改造策略，例如,IP中间产物可以直接用来脱磷生成异戊二烯醇，以缩短合成路线，提高合成效率[37]。从化学计量学的角度来看，利用MVA通路从碳源(如葡萄糖)合成IPP和DMAPP是1个多余的合成NADH还原力的过程，进而表现出碳源利用的低经济性；而利用MEP通路进行合成则是一个高经济性的过程，但需要额外的还原力，耦联这2条通路，可达到碳源和能量的平衡态，补料分批发酵此工程菌株可产出24 g/L异戊二烯，产率达到0.267 g/g(以1 g葡萄糖质量计)[38]。

2.3 枝端合成途径的代谢工程

在优化MEP和MVA途径、建立IPP和DMAPP供给平台的情况下,引入不同的枝端萜类合成通路就可实现目标萜类产物在大肠杆菌中的合成。迄今为止，数以千计的植物、真菌或细菌来源的萜烯合成酶信息已收录在数据库中，这为大肠杆菌合成不同的萜类产物提供了可能。事实上，如前所述的许多案例也证明了这一点。萜类在自然界中作为次级代谢产物，产量极低，这可能是萜烯合成酶的催化活性(kcat)偏低，因而不能高效高产萜类化合物。萜烯合成酶尽管在蛋白质序列上表现出很大的差异，但是它们都共享1个多α-螺旋骨架结构和极度保守的催化结构域，因此，研究者们得以理性设计和/或随机进化来编辑萜烯合成酶，提升其催化活性。例如，以理性设计法高通量筛选获取的蒎烯(pinene)合成酶合成蒎烯的能力提升了1倍；对左旋海松二烯合成酶催化域进行理性设计，其合成能力提升了10多倍[39]。

萜烯合成酶类除表现出专一产物的合成活性外，还有相当一部分具有合成多种产物的广谱活性。以此特性为蓝本，萜烯合成酶可以按照需求进行定制[40]，或通过改变其底物的供给来合成不同的产物[41]。各种萜基焦磷酸中间产物可经脱磷直接合成萜基生物燃料，因为萜类的结构重排没有特殊要求。因此，很多研究组在挖掘现有磷酸酶对萜基焦磷酸脱磷新功能方面进行了很多尝试。大肠杆菌磷脂酸甘油磷酸酶PgpB和YbjG可对FPP进行脱磷继而合成法尼醇[42]。Nudix水解酶家族成员NudB、NudF对IPP和DMAPP表现出很强的水解脱磷活性[43-44]，利用NudB大肠杆菌工程菌株可在摇瓶培养条件下合成2.2 g/L异戊二烯醇[45]。

对萜烯母核进行修饰合成更具生物活性的萜类产物方面有待更进一步的研究。细胞色素P450和其还原酶伴侣分子相融合能提高P450对萜烯的加氧活性[46-47]，以克服大肠杆菌本身低下的加氧修饰能力及不利的合成环境。此外，多菌联合培养过程(consortia process)整合各自的生产特性或许是一条值得尝试的策略[48]。

2.4 大肠杆菌细胞底盘代谢工程

系统生物学研究使得在多重组学(omics)水平上解析宿主代谢网络和外源通路相互应答，进而加深底盘代谢网络理解，为最终提升萜类或其他化合物产量提供保障[49-51]。在大肠杆菌中合成亲脂性萜类物质，需要转运到胞外或者存储到细胞膜上。分子量小的二萜(≤C20)等可以通过两相双层培养的方式将合成产物原位萃取到胞外有机相[52]，其通过膜通道转运蛋白进行转运的途径也取得进展[53-54]；然而，三萜、四萜产物却很难通过两相双层培养萃取到有机相中再透过细胞膜，对其通过转运通道蛋白向外转运也并不理想[55]。研究者试图通过编辑细胞膜以拓展其存储空间，例如通过细胞内膜的拓展，β-胡萝卜素的单细胞产量提高2.9倍[56]。大肠杆菌底盘细胞的代谢工程还有很多方面的工作值得人们继续深入研究。

3 总结和展望

代谢工程的发展使微生物合成萜类产物成为可能，并展现出微生物细胞工厂合成此类物质的巨大潜能和优势。通过各种创新性的策略，优化主干通路和枝端通路，成功合成了一大批萜类物质。但是与种类纷繁的萜类化合物相比，更多的合成工作亟待挖掘。从合成产能(titer、rate和yield)角度考虑，现有的工程菌株和策略与工业生产尚存有距离。在大肠杆菌微细胞工厂中大量合成萜类产物必然会打破细胞既有的代谢网络，将来的研究可能集中在以下四方面：①萜类化合物合成途径优化，如，RBS调控、通路模块化、同源酶替换等。②大肠杆菌细胞底盘改造。如，菌株进化、系统生物学代谢网络解析。③萜类产物的转运和存储。如，膜通道转运蛋白挖掘、膜容积拓展。④萜类母核修饰途径。如，P450加氧酶编辑、多菌联合培养过程等。除对主干和枝端通路进行不断优化外，还需要借助于系统生物学，解析和打造优质的大肠杆菌合成底盘，建立改造高效的萜类产物转运途径和存储空间，开发可行性高的母核分子修饰途径。我们相信改造大肠杆菌这一研究最为透彻的模式生物必将开创出微生物细胞工厂新局面，为工业规模化合成有用萜类物质奠定基础。