静电纺丝在神经修复中的研究进展

李一君,刘哲鹏

上海理工大学 医疗器械与食品学院(上海，200093)

0 引言

神经损伤是一种全球普遍性的疾病，影响着全世界数百万人，尤其对于青壮年来说，这可能会使他们患有认知、运动或精神上的永久性残疾，导致其社会和经济负担增加，降低其生活质量[1]。尽管成年哺乳动物周围神经系统具有自我再生能力，但如果不采用治疗干扰，自发神经再生有极大可能会导致神经功能不全[2]。

周围神经损伤的治疗方法大致分为三种：直接端对端缝合，自体移植和组织工程化神经移植物。直接缝合受损神经的成功率高达70%，但是神经末端无法过度拉伸，较大的损伤间隙(>5 mm)则需要替代技术[3]。采用自体移植的方法治疗大间隙周围神经损伤，在一定程度上能够降低排异反应，但移植过程中切除的腓肠神经可能导致疼痛敏感性降低甚至丧失[4-5]。组织工程化神经移植物的出现可以替代传统的神经吻合术来治疗神经损伤，一些实验和临床前研究已经报道了使用组织工程化神经移植物作为自体神经移植物的替代物来桥接周围神经缺损的可行性[6]。组织工程化神经移植物培养过程中必不可缺的就是组织工程支架，支架既可以作为体外细胞生长分化的依靠，又可以直接植入受损部位促进神经，在组织工程中占据了重要地位。

常见的组织工程支架制备方式有：自组装[7]、3D打印[8]、静电纺丝[10]等。自组装过程简单高效也在智能神经纳米支架方面取得了一定的进展，但是其产生的不良反应较多，而且其形貌外观可控性较差[7]。3D打印法设计多样化，能够精准地复制设计结构，但是对材料要求较高部分材料无法使用该方法，且微纳米级的3D打印设备价格高昂[9]。而与其他几种方法相比，静电纺丝可以制备出均匀连续的微米或纳米纤维，且制备方法简单，纤维尺寸可控，对于材料的要求不高，因此，在组织工程支架制备中占据重要地位。

1 纺丝材料对神经修复的影响

细胞外基质不仅影响控制细胞行为，还为组织提供结构和机械支持[10]。作为组织工程支架不仅需要有适宜的降解速率、理化性质和力学性能，还需要在结构和功能上与细胞外基质相似，有利于细胞粘附和生长。

1.1 单一材料

天然材料的空间结构与细胞周围的大分子非常相似，在支架设计方面具有一定先天的优势。常用的天然聚合物有胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖、藻酸盐等[11-13]。壳聚糖其表面具有丰富的正电荷基团有助于神经前体细胞的长期存活。Du等[9]将人神经干细胞接种于制备的壳聚糖、醋酸纤维素和聚醚砜纺丝支架上，培养1天后，细胞在壳聚糖支架上粘附情况最好，与其他两组相比具有显著性差异。7天后，壳聚糖组神经元基因表达明显高于其他两组，且大部分细胞分化为具有长轴突的成熟神经元，而聚醚砜组细胞基本处于未分化状态。

合成高分子聚合物具有良好的生物降解性、力学特性和理化性能，且易于人工控制，有利于支架为细胞生长提供长久的支撑力。左旋聚乳酸(PLLA)纳米支架结构与神经细胞的天然细胞外基质结构类似而被广泛用于神经组织工程，其制备的纤维支架能够指导细胞延伸和迁移[14]。Nisbet等[15]制备了聚己内酯纺丝支架并植入小鼠脑部，3天后附着在纤维上的小胶质细胞数量达到峰值，与此同时星形胶质细胞活化，14天后炎症开始消退，60天支架未引起异物反应，证实了PCL与脑神经组织的相容性良好。此外，常用于神经组织工程的材料还有聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚吡咯(PPY)等[1,16-17]。

1.2 复合材料

由于大部分天然高聚物的降解速度较快，不能长期支持细胞的生长分化；而拥有较慢降解速率的合成高聚物，由于自身的疏水特性其细胞亲和力不强，细胞粘附性较差。且有研究表明，在纯的高聚物支架上培养神经细胞，神经突触丢失，细胞扩散较少，且没有典型表型[18]。因此，近年来研究者们多使用复合材料来获取拥有更好性能的细胞支架。Binan等[19]在PLLA和明胶共纺丝纤维上培养神经干样细胞，细胞成功增殖，2天后开始有神经突触分化，14天后神经元分化与对照组相比具有显著性差异，主要原因是纤维表面明胶层能够确保支架具有良好的细胞亲和力，而PLLA核心可以保证支架能够维持良好的机械性能。在不改变明胶组分前提下，Karbalaei Mahdi等[20]将PLLA替换为具有更久降解时间的PCL，用于人诱导多能干细胞(hiPSC)的神经分化，1天后混纺组细胞活力与对照组具有显著性差异，且3天内没有任何细胞死亡，14天后实验组hiPSCs完全分化为神经细胞，种种实验表明，混纺支架是一种可行的且易于获得的复合材料支架，能够进一步用于组织工程实验。

为了获取更综合的材料特性，Saravani等[21]将自制的半结晶聚甘油癸二酸酯聚合物在不同条件下与不同浓度的壳聚糖和明胶混合进行静电纺丝，对比发现，明胶的加入使纤维更均匀，而且容易获得更高的孔隙率。种PC12细胞24小时后实验组细胞增殖数量明显高于对照区；72小时后，细胞增殖数量最多的是明胶含量最高的静电纺丝支架。因此，可以认为聚甘油癸二酸酯/壳聚糖/明胶纳米复合支架可以用于神经组织工程应用，适量的增加明胶的比例可以增强细胞活力。

2 纺丝结构对神经修复的影响

2.1 纤维表面结构

由于纤维表面形貌影响材料的微观行为，在聚合物表面上产生纳米级表面特征，模拟活组织的自然粗糙度，能够促进细胞生长和增殖。Zamani等[22]制造了独特的PLGA纳米纤维结构，将支架制备成具有光滑和粗糙表面的圆柱形和带状纤维。将人胶质母细胞瘤细胞接种于纤维上用于评价细胞活力，与平滑和常规电纺支架相比，PLGA电纺支架的纳米粗糙度可以将细胞生长速率提高至50%，粗糙的圆柱形支架增强了神经的生长和增殖，同时还发现细胞增殖和表面特征之间存在一定的线性相互作用。

角蛋白(KOS)，广泛存在于脑灰质、脊髓和视网膜神经中，具有改善聚合物纳米纤维生物相容性和生物活性的潜力。然而，由于角蛋白的可纺性差，在共混纳米纤维中添加角蛋白会降低纳米纤维的机械性能，会导致角蛋白在纳米纤维内的分布不均匀。而Guo等[23]采用表面涂布的方式将角蛋白纳米粒子(KNPs)通过电喷雾沉积的方式涂布于PVA静电纺丝纳米纤维，并用于PC12和C6细胞培养。结果表明，与PVA纳米纤维和KOS/PVA共混纳米纤维相比，KNPs/PVA纳米纤维在细胞形态、粘附和增殖方面表现出更好的细胞生物相容性。

2.2 纤维空间结构

早期Yang等[24]通过研究发现静电纺丝制备的纳米纤维支架不仅具有类似于天然细胞外基质的结构，而且能够支持神经干细胞的增殖、分化和粘附。与微米级纤维相比，纳米级纤维促进细胞生长分化的作用，更为突出。目前，已有研究表明定向排列的纤维能够诱导神经细胞的分化，促进神经突触的生长[25]。Zhu等[26]结合了静电纺丝和静电喷雾技术，在具有高度排列的PCL微纤维框架上嵌入具有核壳结构的PLGA生物活性因子纳米球，用于细胞培养，观察发现，高度对齐的支架增加了神经突的长度和沿纤维方向伸长的定向神经突。Lins等[27]将神经干细胞接种在未对齐和对齐的支架上，细胞接种后，无序纤维上神经细胞伸长方向也呈现随机状态且特征分化不明显；而对齐纤维上细胞伸长方向与纤维方向基本水平，神经突触生长速率明显优于无序纤维。根据纤维排列的函数结果显示，在对齐纤维上神经元和神经胶质细胞中神经突触的生长和分化能力的显著变化得到证实。综上所述，有序的纤维支架可以作为神经细胞存活和分化的指导性支架。

细胞生长是一个三维立体的过程，具有空间结构的支架更有利于细胞的生长分化。Jakobsson等[28]制备了带有金属探针的两个同轴圆形铁环用来代替传统的平面收集版，来获得具有三维结构的纺丝支架，而且可以通过调整探针的长度和位置，来调整纤维支架的形态。接种人类神经干细胞培养20天后发现，在2D支架表面，星形胶质细胞是附着于培养表面的致密的平坦的单层细胞，只有较少神经突生长在相邻神经元的顶部，细胞培养物厚度平均为14.3 μm。而在3D支架上，胶质细胞和神经元细胞从未发现形成分层结构，在空间上存在多个长达40 μm的神经突，促细胞分化效果明显强于2D平面支架。而且通过静电纺丝制备的3D支架，是未经过空间压缩的连续三维立体结构，理论上能够支撑细胞浸润到整个支架中。

3 纺丝支架在神经修复中的应用

3.1 神经导管

采用天然或合成材料制备的神经导管，能够最小化轴突分散，防止瘢痕形成并为神经修复创造适当的微环境[3]。丝素蛋白(SF)是一种用于组织工程的高度生物相容的生物材料，Gu等[29]制备了SF纺丝支架作为神经导管进行手术移植，用于评估大鼠周围神经修复的结果。手术12个月后，绝大多数导管降解，吸收并被具有神经样外观的组织取代，而自体移植物组，虽然能够完全被神经样组织取代，但是间隙两端神经生长不完全，间隙并没有完全连接修复。通过WalkwayTM步态分析系统综合评估狗的后肢运动功能，结果发现，与非移植组相比，移植组表现出更好的站立稳定性和运动机能，而移植组内部对比并没有显著性差异。这足以表明SF-支架促使受伤后肢的行为恢复几乎等同于自体移植物。

施旺细胞是支持周围神经损伤修复和再生的主要细胞，Farzamfar等[30]将接收使用的铝箔固定在聚丙烯凝固浴底部，获得了具有海绵状结构的细胞支架，用于原代施旺细胞培养。细胞接种3天后支架组细胞活力明显优于其他组，具有显著性差异。第60天结束时支架组的坐骨神经功能指数(SFI)值高于自体移植物和对照组的指数值。显然，制备的支架能够显着增强损伤神经的再生功能，具有一定的适应性。

3.2 调控细胞因子的释放

神经修复过程中，神经细胞因子的表达对治疗效果有一定的影响，西酞普兰治疗可以增加脑源性神经营养因子(BDNF)的表达，体内研究表明，BDNF可以预防周围神经损伤后的神经元死亡，并通过激活细胞促进轴突再生，从而增加神经纤维的生长和更快的神经再生。Naseri-Nosar等[31]以聚乳酸为核心，醋酸纤维素为壳层，通过同轴静电纺丝技术制备了纤维支架，然后用纳米沉淀法将装有西酞普兰的明胶纳米载体(CGN)涂覆在支架表面，并将支架组装成神经导管植入大鼠坐骨神经缺损处，在手术45天和60天内对照组神经功能指数几乎没有改善，60天时为-88.06±2.60；而导管组SFI指数明显改善，60天时为-34.23±4.15。同时支架组的大鼠体重减轻百分比值(4.18±0.26)%明显小于未涂层支架(12.59±4.18)%，P<0.05。实验证明含有西酞普兰的支架显著增强了神经再生的能力，证明其对神经组织工程的适用性。

巨噬细胞通过制备周围的薄壁组织进行再生，在周围神经损伤后的组织再生中发挥关键作用。白细胞介素10(IL-10)是促进巨噬细胞向抗炎/伤口愈合状态的细胞因子。Jason等[32]将IL-10共价结合到电纺聚己内酯纳米纤维支架上，将得到的纤维包裹在大鼠的坐骨神经周围，通过精氨酸酶1或CD206双重标记的M2巨噬细胞证明IL-10缀合的纳米纤维成功地诱导巨噬细胞极化朝向支架材料内的M2激活状态以及神经周围的邻近组织。同时，植入体内后纤维上的IL-10能够维持长达14天的持续释放。

基质细胞衍生因子(SDF-1-α)及其信号受体CXCR4存在于胚胎以及成人中枢神经系统(CNS)中的神经干细胞(NSCs)，能够调节神经生态位中干细胞归巢并促进干细胞向神经元和神经胶质细胞分化。Dai等[33]通过静电纺丝技术制备了具有不同梯度浓度的细胞衍生因子(SDF-1-α)的胶原蛋白垫。通过接种神经干细胞检测其对具有各种梯度模式纤维垫的反应，实验结果表明NSCs对细胞衍生因子较为敏感，并倾向于具有更高SDF-1-α含量的区域迁移。接种细胞1天后NSCs开始分化，7天后细胞染色结果发现随着SDF-1-α含量的降低，神经元和星形胶质细胞分化减少，再次证明梯度支架可以诱导细胞定向分化。综上，通过静电纺丝制备含有细胞因子或者促细胞因子药物的纤维，能够促进细胞的生长分化，增强治疗效果。

4 展望

通过静电纺丝法制备的纤维支架不仅对材料的要求较低，而且能够适用于多种修复手段，能够广泛地应用于神经修复治疗过程中。未来进行优化的方向主要分为以下几个：(1)纺丝材料，通过材料组合或者改性，获取更有亲和力和稳定性的材料；(2)空间结构，纺丝的空间结构主要受针头和收集方式影响，通过针头改造以及收集方式优化获得与神经结构更加相似的纺丝；(3)纺丝产量，提高流速或者多通道同时纺丝以获得更高的产量。静电纺丝作为一个交叉学科，就神经修复应用方面而言，不仅需要对材料、电场、机械等学科有着深入了解，还要了解神经学、细胞学、药学等多个学科。综合各学科优势特点，静电纺丝在神经修复领域会有更广阔的发展空间。