食用槟榔中苯并芘检测方法研究进展

傅孝美 李宗军 赵志友 罗凤莲

(1. 湖南农业大学食品科技学院，湖南 长沙 410128；2. 湖南宾之郎食品科技有限公司，湖南 湘潭 411100)

槟榔(ArecacatechuLinn)是槟榔属棕榈科槟榔亚科槟榔族槟榔亚族的常绿乔木[1]。槟榔主要种植在中国的海南和台湾，海南95%以上的槟榔以干果的形式直接销往湖南加工成食用槟榔(亦称槟榔嚼块)，还有少部分以鲜品形式直接作为咀嚼嗜好品在本地食用；在台湾是以直接嚼食鲜品为主，并衍生出“槟榔西施”“红唇族”等台湾特有的槟榔文化[2]。如今，槟榔已发展成为海南第二大热带经济作物，仅次于天然橡胶[1，3]。

随着槟榔产业的不断发展壮大，食用槟榔的质量安全也备受关注。鲜果槟榔在干制烟熏成黑果时会污染苯并芘等有毒有害物质，国际癌症研究机构已将苯并芘鉴定为1类致癌物(人类致癌物)[4]。文章归纳了食用槟榔中苯并芘的污染来源，对比介绍了几种槟榔中苯并芘的检测方法，旨在为食用槟榔中苯并芘的检测提供参考。

1 食用槟榔中苯并芘的污染来源

食品中苯并芘的污染来源主要包括木材、石油不完全燃烧、食品加工过程、包装材料污染以及沥青中的苯并芘污染等途径[5]。槟榔鲜果通常在绿熟期进行采摘，在海南经初加工制成干果，再运销湖南进一步加工制成槟榔嚼块。槟榔初加工产品分为青果和黑果，青果是将槟榔鲜果进行蒸煮杀青，再烘干至水分含量为20%左右，制成无烟熏味的槟榔干果[6]；黑果则是利用传统的烟熏烤炉将蒸煮杀青后的槟榔鲜果熏干，制成水分含量约26%的槟榔干果。经烟熏的槟榔干果因有大量熏烟颗粒附着在其表皮而发黑，故称为黑果[7]。传统的烟熏烤炉是利用橡胶木材碎屑暗火燃烧熏干槟榔或是用蜂窝煤球直接熏干槟榔，熏烟中含有苯并芘，在高温下随着熏烟附着到槟榔表面，并逐步渗入内部。康效宁等[8]研究发现，经传统烟熏烘烤方式加工制成的槟榔干果，其苯并芘残留量高达26.52 μg/kg，参照GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》中谷物及其制品苯并芘残留限量5 μg/kg，其含量为限量标准的5.3倍，而经后加工制成食用槟榔后，苯并芘的含量降低到安全标准内。在槟榔干果加工成槟榔嚼块的过程中，经泡籽、清洗、煮籽、蒸籽、烘烤、发制等多个加工工序，苯并芘含量大幅度下降[9]，严聃等[10]研究发现在食用槟榔加工过程中，通过清水反复清洗可使槟榔表面烟垢吸胀疏松，有利于后工序除去烟垢，再经0.5%纯碱和0.2% CMC混合液浸泡槟榔烟果，苯并芘残留基本无检出。但烟果槟榔加工过程中苯并芘的变化规律还有待进一步研究。

2 苯并芘的性质及危害

苯并芘由5个熔融的苯环组成[11]，呈无色或淡黄色针状晶体，熔沸点较高，不溶于水，密度比水大，微溶于甲醇、乙醇，易溶于苯、甲苯、正己烷等有机溶剂。苯并芘是多环芳烃类化合物的代表，具有很强的致癌性、致畸性和诱变性，常被作为多环芳烃的指标化合物[12]。苯并芘主要通过食物、饮用水及吸入污染空气而进入人体，随血液循环遍布全身，并在脂肪和乳腺细胞中不断蓄积。Malik等[13]证实了苯并芘诱导乳腺癌发生的发病机理。张雪莲等[14]研究表明，苯并芘暴露会增加肺癌发病率，并且随诱导时间的延长，肺癌发病率和肿瘤数不断升高。Widziewicz等[15]研究了部分燃烧煤炭、木材较多的地区，发现空气中的苯并芘浓度高于2007/107/EC指令中苯并芘浓度目标值(1 ng/m3)2～5倍，长期暴露在含有苯并芘的空气环境中，会造成慢性中毒，吸入性肺癌的发病率明显提高。苯并芘还有生殖毒性，会导致哺乳类动物精子畸变[16]，导致胚胎畸变或死亡[17]。由于苯并芘的强致癌性，美国环境保护署已将其作为优先污染物，并对其进行日常环境监测[18]。

3 食用槟榔中苯并芘的检测方法

3.1 前处理方法

被污染的食品中苯并芘含量极低，但微量的苯并芘对人体的危害也较大，且苯并芘性质稳定，因此对于较复杂的食品基质，做好样品的前处理对检测结果的准确性尤为重要。目前，检测苯并芘的前处理方法有固相萃取法[19]、超声辅助基质分散固相萃取法[20]、涡旋辅助液液萃取法[21]、QuEChERS法[22]等，其中固相萃取法是应用最广泛的前处理方法。槟榔中粗纤维含量高，有机酸、多酚类物质、生物碱等种类多样，含量丰富，而脂肪、蛋白质等高分子物质含量较少，且主要分布在槟榔果核中，果皮和果肉中含量较低[23-26]。基于食用槟榔这种特殊基质，苯并芘检测的前处理方法主要有固相萃取法(Solid Phase Extraction，SPE)、凝胶渗透色谱法(Gel Permeation Chromatography，GPC)和分散固相萃取法(Dispersive Solid Phase Extraction，DSPE)。

3.1.1 固相萃取法 SPE法是利用固体吸附剂将样品中的待测组分与干扰组分分离的方法，该方法将待测组分吸附在萃取柱上，而干扰组分被洗脱除去，达到样品净化的目的。通常根据样品性质和提取溶剂性质，选择不同的吸附填料。常用的固相萃取柱有中性氧化铝柱、分子印迹柱、PSA固相萃取柱、弗洛里硅土固相萃取柱等。现行苯并芘国家检测标准(GB 5009.27—2016《食品安全国家标准 食品中苯并芘的测定》)采用的前处理方法为正己烷溶剂提取，再用中性氧化铝柱或分子印迹柱净化样品，液相色谱—荧光法检测。梁振纲[27]基于国标方法对槟榔中苯并芘的前处理方法进行了改进，用正己烷提取，再用二甲基亚砜二次提取，采用PSA固相萃取柱净化样品，将净化液用液相色谱—荧光检测器进行检测。由于PSA固相萃取柱对槟榔中的有机酸、色素、酚类等物质有较好的分离效果，该方法显著减少了图谱杂峰，干扰峰响应降低了60%，而苯并芘响应无明显变化，方法平均回收率为83.0%～114.5%，RSD为1.27%～ 6.78%，检出限为1 μg/kg。何秀芬等[28]提出了一种测定干槟榔中痕量苯并-α-芘的气相色谱—质谱联用法，样品经氢氧化钾皂化，用正己烷溶剂提取，再用弗洛里硅土固相柱净化，正已烷—二氯甲烷混合液(6+2)洗脱、浓缩，最后以气—质联用进行检测，该方法检出限为0.5 μg/kg。

3.1.2 凝胶渗透色谱法 GPC法的分离原理为物理分离，不同体积大小的粒子流经不同孔径的色谱柱时，根据相对分子质量的不同将分子进行分离，从而使样液达到分离纯化的效果[29]。喻玺等[30]研究了高效液相色谱—荧光检测法检测食用油中的苯并芘，发现凝胶渗透色谱法精密度高于中性氧化铝柱和分子印迹柱两种方法；凝胶渗透色谱、氧化铝柱法、分子印迹柱法的平均回收率分别为100%，119%，90%，前者准确度高于后两者。凝胶色谱能有效分离待测样品中的油脂、蛋白质等高分子物质，适用于脂肪等大分子物质含量较高的物质的检测。

3.1.3 分散固相萃取法 DSPE法是将吸附填料直接加入到样品提取液中，使之充分混合。干扰物则通过吸附剂吸附除去，得到净化液，再上机分析[31-33]。王利等[34]建立了检测食用槟榔中多环芳烃的气相色谱—质谱联用的方法，该方法将样品用正己烷提取，提取液先经凝胶渗透色谱柱净化分离，收集净化液，再选用硅胶作为分散吸附剂，与净化液充分混合得到二次净化液，再上机分析；同时对比了硅胶、Alumina-N、PSA 3种分散吸附剂，发现硅胶的加标回收效果最好，准确度最高；检出限为0.2～1.0 ng/mL，RSD≤4.38%。

3.1.4 其他方法 鉴于只针对食用槟榔中苯并芘的检测方法研究较少，而谷物类基质与槟榔基质相接近，以谷物及其制品为参考对象，学习借鉴谷物中苯并芘的检测方法。黄坤等[35]建立了一种简单、快速、准确可靠的高效液相色谱—荧光法检测大米和小麦粉中苯并芘残留的方法，该方法的检出限为0.1 μg/kg，加标回收率为86.08%～98.17%。于海燕等[36]应用液相色谱—荧光法检测谷物中15种多环芳烃，该方法的检出限为0.02 μg/kg，加标回收率为90.0%～110%，灵敏度高、重现性好。阮丽萍等[37]建立了高效液相色谱—荧光法测定果蔬及谷物中PHAs的检测方法，该方法的检出限为0.1 μg/kg，回收率为60.0%～137.8%。上述方法简化了前处理过程，精密度高、回收率稳定，同时降低了检测成本。

3.2 仪器分析方法

常见的食品中苯并芘的仪器分析方法有高效液相色谱—荧光法(High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detection，HPLC-FLD)、液相色谱—质谱联用检测法(Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer，LC-MS)、气相色谱—质谱联用检测法(Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)、表面增强拉曼光谱检测法(Surface-enhanced Raman Spectroscopy，SERS)[38]。最常用的方法是HPLC-FLD法和GC-MS法。

3.2.1 HPLC-FLD法 利用苯并芘的荧光属性，其荧光响应值与浓度构成一定比例关系，可根据响应值计算得出样品中的苯并芘含量。该方法结合了液相色谱的高效分离和荧光检测器高灵敏度的优点，但对样品前处理要求较高。与液相色谱—紫外检测法相比，HPLC-FLD法灵敏度和准确度更高。宋长虹等[39]比较了检测食品中苯并芘的4种不同的前处理方法和2种不同的检测器，发现荧光检测器精密度高于紫外检测器，最低检出限分别为0.1，2.8 μg/kg。张海龙等[40]建立了高效液相色谱法检测菜籽油中苯并芘的方法，该方法的加标回收率为87.0%～98.5%。

3.2.2 GC-MS法 利用气相色谱将待测组分与干扰组分分离，再用质谱对待测组分进行定性定量分析。质谱检测器具有高定性能力的优点，几乎能检测出经气相色谱分离后的所有组分，但对色谱柱要求较高[41]。王磊等[42]利用GPC-GC-MS技术结合选择离子扫描模式(Selective ion mode，SIM)建立了检测花生油中苯并芘的方法，该方法的检出限为0.5 ng/kg，平均回收率为93.2%～98.6%。杨玲等[43]对比了GC-MS和HPLC两种测定苯并芘的仪器方法，发现GC-MS法的保留时间略短，两种方法的精密度和检出限均能较好地满足环境水样中苯并芘的检测，但对基质较复杂的实样，GC-MS法可较好地避免杂峰的干扰。

3.2.3 LC-MS法 结合了液相色谱有效分离热不稳定性及高沸点化合物的分离能力和质谱仪较强的定性定量分析能力，具有快速分析、高灵敏度、高分辨率鉴定和可分析多个化合物等优点，是一种分离分析复杂有机混合物的有效方法。吴春英等[44]建立了超高效液相色谱质谱联用法检测地沟油中黄曲霉毒素和苯并芘的分析方法，该方法的回收率为80.9%～115.6%，各目标物检出限为0.091～0.210 μg/L。目前该方法由于溶剂难挥发，基质效应高，不利于分辨，还处于发展阶段，应用不够普遍。

3.2.4 SERS法 利用待测物被吸附在金、银等粗金属表面时，拉曼散射的信号会较大程度地提高的原理，将待测物与表面增强拉曼光谱的活性基底结合，再利用光的拉曼散射效应对待测物进行定性定量分析。由于该方法具有快速、无标记、无损检测等优点，已被广泛应用于食品和生物样品中化学物质的检测。肖旺[45]制备了硫醇修饰的银纳米点阵列作为SERS活性基底，实现了水中苯并芘的快速检测，并结合分子印迹技术分离净化待测物，SERS方法进行分析，实现了食用油中苯并芘的检测。王珊[46]制备了纳米金修饰的氨基改性硅烷化担体新材料作为SERS活性基底，用于快速检测食用油中苯并芘残留，检出限为5.6 ng/mL。目前，SERS法还不够成熟，不同物质对基底的选择性要求较高，不同材料同基底的吸附性也存在差异，稳定性和重复性难以控制。

4 结论与展望

研究表明，苯并芘的前处理过程分为提取和净化两个过程，用固相萃取技术净化居多，前处理过程仍存在操作繁琐、耗时长、试剂毒性大等问题，且净化过程中由于吸附剂会对待测物有一定吸附作用而造成待测物的损失，使得检测结果偏低。由于目前对食用槟榔中的苯并芘残留检测技术研究较少，急需研究简单、快速、准确的槟榔中苯并芘的检测技术。

鉴于食用槟榔基质相对简单，在研究苯并芘化学检测方法时可参考谷物类，省略净化过程，改进仪器分析条件来提高目标物与杂质的分离度。目前最常用的分析仪器是HPLC-FLD，具有较高的精密度和灵敏度，能满足低含量样品的精确定量分析。GC-MS和LC-MS具有高灵敏度和高分离能力，但成本较大，且耗时长，不适于大批量样品的快速检测。SERS技术适用于基质简单的样品的快速检测，具有简单便携、无标记、无损检测等优点，但目前技术发展还不够成熟，对槟榔嚼块中苯并芘的检测有待研究。