亮氨酸和α-酮戊二酸对小鼠体重、血清及脏器的影响

金顺顺 姚 康 印遇龙 康宝聚 黎育颖 王 鹏

(1. 中国科学院亚热带农业生态研究所，湖南 长沙 410125；2. 中国科学院亚热带农业生态过程重点实验室，湖南 长沙 410125；3. 中国科学院大学，北京 100049；4. 湖南农业大学动物科学技术学院，湖南 长沙 410128)

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate, AKG)是三羧酸循环的关键中间体[1]，也是谷氨酰胺脱氨(谷氨酰胺水解)的产物。其在临床和动物营养方面发挥着有益的作用，能改善动物生长性能、调节能量代谢、提高动物免疫力、促进骨骼肌蛋白质合成等[2]。体外研究[3]发现，AKG能通过促进猪肠道上皮细胞蛋白质的合成和降低蛋白质的分解来促进猪肠道上皮细胞蛋白质的合成。亮氨酸(leucine，LEU)是必须氨基酸，也是支链氨基酸之一[4]，还能在动物体内影响脂质代谢，主要是通过抑制脂肪的合成[5-7]以及促进脂肪的分解[8-10]来发挥作用。据报道[11]，亮氨酸能调节哺乳动物骨骼肌蛋白质的代谢，从而达到促进动物生长的作用。肖定福等[12]研究表明，在动物体内谷氨酰胺向AKG转化的过程中，首先谷氨酰胺由磷酸盐活化谷氨酰胺酶反应产生谷氨酸，再通过线粒体中谷氨酸脱氢酶的作用或通过转胺作用在细胞溶胶或线粒体中产生AKG，这个代谢过程中，亮氨酸是谷氨酸脱氢酶的激活剂，因此，在生物体的代谢过程中亮氨酸和AKG存在协同作用。这预示着亮氨酸和AKG可能对机体内骨骼肌蛋白质的合成代谢有协同作用。而加强骨骼肌蛋白质的合成是解决肌肉萎缩的重要一步[13]。骨骼肌蛋白的合成已被证明受到不同营养和生理因素的影响，如氨基酸[14]、葡萄糖[15]、运动[16]、胰岛素样生长因子-1(insulin like growth factor -1，IGF-I)和胰岛素[17]等。综上所述，亮氨酸和AKG两者都对小鼠的生长性能和骨骼肌产生影响，且两者在生物体内代谢过程中存在协同作用，然而联合使用AKG 和亮氨酸对健康小鼠生长以及骨骼肌的影响，目前未见报道。因此试验探讨了亮氨酸和AKG联合使用对小鼠的体重，血清生化指标、器官指数和骨骼肌纤维的影响，以期为运用亮氨酸和AKG改善蛋白质降解引起的肌肉萎缩提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

AKG：有效成分含量为99.5%，武汉远成共创科技有限公司；

亮氨酸：有效成分含量为98%，上海源叶生物科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

冷冻型大容量离心机：4K15型，德国Sigma公司；

生化分析仪：cobas c311型，瑞士罗氏公司；

电子天平：GL124-1SCN型，深圳市盛美仪器有限公司。

1.1.3 试验动物与饲粮

试验动物：4周龄的雄性C57BL/6小鼠，体重(12.76±0.67) g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司；

小鼠专用饲料：主要营养水为粗蛋白质(CP)20.50%、粗脂肪(EE)4.62%、钙(Ca)1.23%、磷(P)0.91%、赖氨酸(Lys)1.30%、蛋氨酸+胱氨酸(Met+Cys)0.68%、亮氨酸(Leu)1.40%，湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

1.2 试验设计

将40只C57BL/6小鼠于21～25 ℃、相对湿度60%的饲养房中饲养1周后，随机分为4组，每组10只。对照组：水瓶中加入正常的饮水；Ⅰ组：水瓶中加入1.0%的AKG(每千克水中加入10 g AKG，并调节pH值至7.4)；Ⅱ组：水瓶中加入1.8%的亮氨酸(每千克水中加入18 g亮氨酸)；Ⅲ组：水瓶中加入1.8%的亮氨酸和1.0%的AKG(每千克水中加入18 g亮氨酸和10 g AKG，并调节pH值至7.4)。试验期35 d。

1.3 样品的采集

试验结束后，各组小鼠禁食(自由饮水)12 h，对所有小鼠进行眼球摘除采血，将采集的血液置于离心管中，低温(4 ℃)下静置30 min，离心10 min (4 ℃、3 000 r/min)，于-20 ℃保存备用。采血后，对小鼠采用脊椎脱臼法处死，迅速取出心脏和肝脏。将心脏和肝脏用预冷生理盐水漂洗，滤纸吸干水分后称重；取腹部脂肪、肩周脂肪、肾周脂肪、皮下脂肪、趾伸长肌、腓肠肌称重并留用。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 体重 在正式试验开始和结束时利用电子天平对每只小鼠分别进行称重，分析体重变化。

1.4.2 器官指数的测定 在试验结束后屠宰小鼠，取心脏、肝脏、腹部脂肪、肾周脂、皮下脂肪、腓肠肌、趾长伸肌称重并记录。心脏、肝脏、腹部脂肪、肾周脂、皮下脂肪指数的计算参照丁晓东等[18]的方法，腓肠肌和趾伸长肌指数的计算参照石鹤坤等[19]的方法。

1.4.3 血清生化指标的测定 采用全自动血液生化分析仪对总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、葡萄糖(GLU)、血氨(BA)进行分析。每组10个重复。

1.4.4 腓肠肌横截面积的测定 腓肠肌横截面积的测定于腓肠肌统一位置切取组织块(0.6 cm×0.6 cm×0.6 cm)浸入10%中性福尔马林溶液中固定，经脱水、透蜡、包埋，切片后，进行HE染色，光学显微镜进行观察，每个切面选取10个图片，然后用Image-Pro plus 6.0软件分析肌纤维的横截面积(Cross Section Area, CSA)。

1.5 数据分析和处理

试验结果用(平均值±标准误差)表示，采用SPSS 20.0进行单因素方差分析，模型显著时采用Duncan氏多重比较检验。P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 AKG和亮氨酸对小鼠体重变化的影响

由表1可知，在连续饲喂35 d中，各组小鼠均未出现任何异常反应。在试验结束第1周，3个处理对小鼠的体重均未产生显著影响(P>0.05)；在第14天和第21天时，Ⅰ组小鼠体重显著高于Ⅲ组(P<0.05)，其他各组之间无显著性差异(P>0.05)；试验第28天时，Ⅲ组小鼠体重显著低于Ⅰ和Ⅱ组(P<0.05)，其他各组之间无显著差异(P>0.05)；试验第35天时，Ⅲ组小鼠的体重显著低于Ⅰ组、Ⅱ组和对照组(P<0.05)，其他各组之间无显著差异(P>0.05)。小鼠饮水中添加亮氨酸和AKG较其他3组体重有降低的趋势。原因可能是动物机体内由磷酸盐活化谷氨酰胺酶反应所产生的谷氨酸能通过线粒体中谷氨酸脱氢酶的作用或通过转胺作用在细胞溶胶或线粒体中产生AKG，在这个代谢过程中，亮氨酸是谷氨酸脱氢酶的激活剂，因此可以强化AKG的作用。另外AKG也可参与脂质代谢和肉碱的形成[20]。而肉碱是一种作为脂肪酸载体进入细胞线粒体的分子，在线粒体中可以进行适当的脂肪分解代谢从而起到降低体重的作用。

2.2 AKG和亮氨酸对小鼠血清生化指标的影响

由表2可见，与对照组相比，Ⅲ组血清TP、ALB和ALP含量显著升高(P<0.05)，BUN和UA含量显著降低(P<0.05)，Ⅱ组血清BUN和UA含量显著降低(P<0.05)，Ⅰ组血清BUN和UA含量显著降低(P<0.05)；与Ⅰ组相比，Ⅲ组血清ALB含量显著提高(P<0.05)，Ⅱ组血清UA含量显著增加(P<0.05)；与Ⅱ组相比，Ⅲ组血清ALB含量显著升高(P<0.05)，BUN和UA含量显著降低(P<0.05)。各组间其他血清生化指标均无显著性差异(P>0.05)。血清中TP的含量可直接反映蛋白质的吸收情况以及机体体液免疫的健康状况，从而间接反映机体对外界不良因素的抵抗能力，血清TP含量高说明蛋白质合成作用、氮沉积及机体对外界不良因素的抵抗能力增强[21]。联合运用亮氨酸和AKG能显著升高血清ALB和TP的含量，表明两者可提高机体的体液免疫能力及肝脏对蛋白质的合成作用。ALP是遗传标记的同工酶，其活性的高低能反映骨组织生长、钙磷代谢、脂肪代谢状况[22]。联合运用两者能显著提高血清ALP的活性，可能与AKG可显著提高粗蛋白、钙和磷的表观消化率有关[23]。同时联合运用两者有利于氨基酸平衡，促进蛋白质代谢以及降低血清中尿素和UA的含量[24]。

表1 试验期间各组小鼠体重的变化†Table 1 Change of body weight of mice from different groups during the whole experimental period (n=10) g

† 同列字母不同表示差异显著(P<0.05)。

† 同行字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.3 AKG和亮氨酸对小鼠器官指数的影响

由表3可知，Ⅲ组心脏指数显著高于对照组、Ⅰ组和Ⅱ组(P<0.05)。其他各组间器官指数均无显著性差异(P>0.05)。联合运用亮氨酸和AKG能显著提高心脏指数，表明两者联合运用能减少外界不良因素对心脏的损伤，促进心脏的生长[25]。

† 同列字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.4 AKG和亮氨酸对小鼠脂肪指数和肌肉指数的影响

由表4可见，与对照组相比，Ⅱ组和Ⅲ组腹部脂肪指数显著降低(P<0.05)，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组腓肠肌指数显著增加(P<0.05)，Ⅲ组趾长伸肌指数显著增加(P<0.05)；与Ⅰ组相比，Ⅲ组腓肠肌指数和趾长伸肌指数显著增加(P<0.05)；与Ⅱ组相比，Ⅲ组腓肠肌指数和趾长伸肌指数显著增加(P<0.05)。其他各组间脂肪指数和肌肉指数均无显著性差异(P>0.05)。联合运用亮氨酸和AKG能显著提高腓肠肌指数和趾伸长肌指数，说明1.0% AKG 和1.8%亮氨酸联合添加在促进骨骼肌生长方面有协同作用。

2.5 AKG和亮氨酸对小鼠腓肠肌横截面积的影响

由表5可知，与对照组相比，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的小鼠腓肠肌横截面积显著增加(P<0.05)；与Ⅰ组相比，Ⅲ组的小鼠腓肠肌横截面积显著增加(P<0.05)；与Ⅱ组相比，Ⅲ组的小鼠腓肠肌横截面积显著增加(P<0.05)。其他各组间小鼠腓肠肌横截面积均无显著性差异(P>0.05)。具体的原因可能是：① AKG能促进骨骼肌蛋白质的合成和抑制骨骼肌蛋白质的降解，从而使得肌纤维的横截面积增大；② 亮氨酸也能促进骨骼肌蛋白质的合成，从而使得肌纤维的横截面积增大；③ 在谷氨酰胺、谷氨酸和AKG的相互转化过程中，亮氨酸促进谷氨酸向AKG的转换，而两者之间存在的协同作用加速了肌纤维蛋白质的合成，从而使得肌纤维的横截面积增加。

表4 AKG和亮氨酸对小鼠脂肪指数和肌肉指数的影响†Table 4 Effect of AKG and leucine on fat index and muscle index of mice (n=10) %

† 同列字母不同表示差异显著(P<0.05)。

表5AKG和亮氨酸对小鼠腓肠肌横截面积的影响†

Table5EffectofAKGandleucineoncrosssectionalareaofgastrocnemiusmuscleofmice(n=10)

组别腓肠肌横截面积/μm2对照组1 873.08±124.16c试验组Ⅰ2 289.84±101.02b试验组Ⅱ2 151.39±78.89b试验组Ⅲ2 751.94±81.13a

† 字母不同表示差异显著(P<0.05)。

3 结论

试验通过对C57BL/6 雄性小鼠研究，比较亮氨酸和AKG对小鼠体重和骨骼肌发育的影响，结果表明亮氨酸和AKG联合运用具有抑制小鼠体重增加，促进心脏生长，加强器官对脂肪的利用和增加腓肠肌纤维的重量和横截面积的作用。研究为提高肌纤维横截面积预防肌肉萎缩提供了新的思路，然而其调节骨骼肌代谢的作用机理还有待进一步研究。