防霉剂在储粮中的应用研究进展

项芳芝 赵 凯 邵 倩 陶 芳

(安徽农业大学生命科学学院，合肥 230036)

中国是农业大国。根据农业部统计，截至2014年，我国粮食总产量已连续增长11年，2014年我国粮食总产量高达60 709.9万t[1-2]。粮食在储藏过程中，受温湿度、含水量等因素影响，极易产生霉变。被真菌毒素污染的粮食不仅品质下降，还威胁着人类的身体健康和生命安全。2008年，我国在进出口贸易中，有164个批次花生遭到真菌毒素污染，其中162例花生受到黄曲霉毒素污染；2010年，长江中下游地区的小麦由于受到赤霉毒素的污染，导致几百万吨粮食无法食用。由霉变而造成的粮食损失可达到粮食总产量的1.5%～3%[3]。因此，粮食的霉变、毒素污染等问题已经成为政府高度重视、社会关注的焦点。

近年来世界各国对粮食的安全储藏越加重视，较为先进的储藏技术主要有气调储藏、低温储藏、环流熏蒸、生物防霉防虫等[4-6]。气调储藏和低温储藏对粮仓密闭和隔热性能的要求较高。环流熏蒸的方法应用已久，但由于磷化氢具有较强的毒性，长期使用会引起害虫产生抗药性[7]。生物防霉防虫技术具有安全无毒的优点，对粮仓设备要求不高、使用方便，是近些年来研究较多的技术，但在实际应用时仍面临着高效、安全等问题。本文主要分析了粮食在储藏期间霉变的原因、防霉剂的分类和对效果评价方法进行了总结，为开展防霉剂的进一步应用研究提供参考。

1 粮食霉变的原因

粮食霉变受到生物和非生物因素的影响。储藏过程中，粮食作物种类、霉菌、温度、湿度等都是影响粮食霉变的关键因素[8]。粮食霉变对粮食品质产生一系列影响，如营养成分降低、发芽率下降、籽粒变色、变味等，严重损耗了粮食的食用价值，甚至导致粮食的使用价值完全丧失。

粮食中的微生物种类很多，主要有真菌、细菌、放线菌等。真菌是粮食霉变的关键“杀手”，如灰绿曲霉、黄曲霉、青霉等。细菌和放线菌等对粮食的危害远远小于真菌。此外，部分霉菌会产生毒素污染粮食。例如，水稻、小麦和玉米等谷物常受到黄曲霉毒素、呕吐毒素、赫曲霉毒素等真菌毒素的污染[9-10]。这些毒素对身体的组织、器官会产生严重的损伤，具有致癌、致畸作用。粮食中霉菌种类因不同的作物、耕作方式、储藏条件而不同，有学者根据来源不同将其分为两种类型：田间储藏型和正常储藏型[11]。而粮食在储藏期间霉菌的种类和数量受种植区域、农作物种类等因素影响差异较大[9,11]。

储粮过程中霉菌的生长代谢与诸多因素有关，主要包括环境的温湿度以及粮食的含水量。当温度、相对湿度和含水量等因素适宜时，霉菌生长旺盛，加速了粮食的霉变。有研究表明，粮食中的霉菌大都属于中温性霉菌，在30 ℃左右生长旺盛。例如，黄曲霉菌的最适生长温度为28 ℃左右，禾谷镰刀菌为25 ℃[10]。粮食入库后，由于堆积和呼吸作用的影响，温度升高，促进微生物的生长和繁殖。当相对湿度处于85%左右时，黑曲霉菌、黄曲霉菌和青霉菌等生长活跃；当相对湿度在65%～70%时，灰绿曲霉、白曲酶等干生性霉菌生长活跃[12]。在我国的部分地区，受阴雨等恶劣天气的影响，空气湿度较大，即使温度较低，入库粮食也会再吸湿而导致含水量高于安全储藏水分，霉菌活动加剧[13]。这一情况在我国南方高温高湿地区显得尤为严重。

2 防霉剂的种类

防霉剂是一类抑制霉菌生长的化学物质，在粮食储藏过程中可直接添加到原粮中。不同的霉菌对特定的防霉剂敏感程度不同。由于防霉剂与食品安全紧密相关，因此对防霉剂的使用具有严格的限定标准。防霉剂应具有以下四个基本条件[14]：1)对霉菌具有高效性和广谱性；2)对人和动物的危害尽可能小，且不造成毒素累积作用；3)稳定性强，不对粮食的品质产生影响；4)原料易得，生产成本低。此外，防霉剂必须通过相关管理部门的安全性验证，才能用于原粮中。目前有关粮食的防霉剂的研究和应用，主要有物理防霉剂、化学防霉剂、生物源防霉剂三种类型。

2.1 物理防霉剂

Ag、Zn、Cu等金属离子及其氧化物具有抗菌功能，通常利用合适的载体来缓释这种抑菌物质，以达到抑菌效果。如将纳米氧化锌负载在沸石、天然膨润土中，可明显提高纳米氧化锌的抗菌性能。其中膨润土——纳米氧化锌复合体对黄曲霉毒素、呕吐毒素、赭曲霉毒素等多种霉菌毒素都具有较好的吸附效果；但防霉剂中的天然膨润土、沸石等载体对营养成分也具有吸附作用，降低了粮食、饲料等的利用价值[14-15]。Li等[15]将纳米银抗菌剂添加到包装膜材料中，与聚乙烯包装材料相比，对黄曲霉菌的生长抑制率提高了23.3%。该包装材料不仅具有防霉、延长货架期的作用，对食品的色泽、口感等也没有影响。

2.2 化学防霉剂

2.2.1 丙酸和丙酸盐

丙酸是一种无色液体，具有强烈的刺激性气味。同时，丙酸也是人体内分泌的一种正常代谢产物，参与体内能量代谢。研究表明，丙酸及丙酸盐类都对霉菌、真菌具有明显的抑菌效果。丙酸的穿透能力强，能够穿透细胞壁，进入霉菌及其孢子中，抑制DNA和蛋白质的合成，从而杀死霉菌及其孢子[16]。杜莉等[18]比较了丙酸、丙酸铵、谷氨酸钠三种液体防霉剂的抑菌效果发现丙酸、丙酸铵的抑菌效果优于谷氨酸钠。另有学者指出，丙酸盐的抑菌成分是丙酸分子，而不是盐类[19]。丙酸型防霉剂由于具有安全高效、抑菌谱广的特点，已在粮食、饲料等行业中被广泛应用。但市场上的丙酸大多是化学方法合成，污染严重，且对合成设备要求高，使得丙酸的合成成本大大提高。

2.2.2 苯甲酸和苯甲酸盐

苯甲酸可降低细胞膜的通透性，阻碍氨基酸吸收，影响膜内呼吸酶的合成。苯甲酸及其盐类对酵母菌、细菌和霉菌等的抑制效果较好[20]。当苯甲酸浓度为0.1%时，可将孢子萌发率降低33%～55%，对菌丝的生长抑制最高可达97%[21]。苯甲酸及其盐类有一定的致突变作用、遗传毒性，但无致畸作用，是轻度蓄积物质[22]。目前，苯甲酸及其盐类主要集中应用在对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制，在医疗和食品等方面应用广泛。而在抑制霉菌的应用方面，发现将苯甲酸钠与肉桂精油复配使用，对黄曲霉菌的生长抑制具有协同作用[23]。

2.2.3 山梨酸和山梨酸盐

山梨酸外观为无色针状结晶或白色结晶粉末，无味、无臭。山梨酸能与微生物酶系统中的巯基结合，从而影响酶的活性，达到抑制霉菌的生长和繁殖，具有较高的抗菌活性[24]。山梨酸钾对曲霉菌、酵母菌的抑制效果强于细菌，其最低抑制浓度仅为对细菌的1/6[25]。此外，将山梨酸及盐类与其他几种防霉剂复配使用，可进一步扩大抑菌谱，提高防霉剂的应用范围。如将紫苏油与山梨酸钾复配，发现这两种抗菌剂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有协同作用[26]。山梨酸钾的毒性仅为苯甲酸的1/4，是一种安全、相对无毒的食品添加剂，被联合国粮农组织和世界卫生组织等机构公认为高效防腐、防霉剂。

2.2.4 双乙酸钠

双乙酸钠分子中的乙酸分子可以穿透细胞壁进入细胞中，降低细胞内的pH，影响细胞内生物酶活性。双乙酸钠对霉菌、细菌及真菌均有较强的抑制性，且具有生产成本低、无毒、稳定性高等优点。因此，美国、加拿大、德国等发达国家都已将双乙酸钠大规模用于食品、粮食、饲料等防霉防腐中。20世纪末，我国也将双乙酸钠作为粮食和食品的防霉剂之一。付春丽[27]比较了10种抗菌剂对饲料青储期间毛霉、米根霉、止青霉、斜卧青霉的抑制作用，发现双乙酸钠对毛霉的的抑制效果最佳，而对其他霉菌的抑制效果一般。而双乙酸钠和乳酸链球菌素复配，不仅扩大了抑菌谱，还起到了协同作用，增强了抑菌能力；此外，防霉剂在使用过程中，通过柠檬酸钠等物质调节pH，能够使抑菌率达到95.98%[28]。

2.3 生物源防霉剂

生物源防霉剂具有来源丰富、绿色安全、高效等优点，在食品、农产品和中药材等防霉中已有运用[29]。迄今为止，生物源防霉剂主要来源植物和动物两个方面。

2.3.1 生物源防霉剂——植物源

植物中含有大量的化合物，其中脂肪族类、芳香族类和萜类等化合物具有抑菌、抗病毒、抗肿瘤等功效[30]。通过蒸馏法、超声波法将植物中的这些生物活性物质进行提取，形成油状且具有挥发性的化合物—精油。精油来源广泛，主要有香辛料、中草药、果蔬、野生植物、曲酸、食用菌[31]。目前，对植物精油的热点主要集中在香辛料和中草药中。

精油中的化学成分复杂，除六大基本营养元素外，还含有挥发油、酚类、萜类等化合物。这些物质可以通过酶抑制作用或巯基反应来抑制微生物的活动[32]。其中，香辛料中的挥发油等成分在防霉、防腐中已进行广泛研究。通过气相色谱和质谱联用分析发现，精油中起到抑菌作用的物质主要为醛类、酚类、酯类和醇类[33-35]。精油的抑菌效果受到温度的影响，Santiago等发现[36]：15 ℃时精油对赭曲霉毒素A的抑制效果好于25 ℃。此外，Boukaew等[33]发现丁香精油在10L/L时，能够完全抑制玉米种子的病虫害感染，而在100L/L时，对黄曲霉菌PSRDC-2的分生孢子抑制率仅达到84.7%；这种现象可能与菌株的类型有关。精油对霉菌生长和产毒也具有抑制作用，其作用机制也是近年来研究的热点。有研究表明，精油是通过降低细胞质膜中麦角甾醇的含量、线粒体ATP酶活性、琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶等酶活性而起到抑菌或杀菌的目的[37]。由于大部分植物精油来自药材食材，对人体的危害小。因此，将植物精油作为防霉熏蒸剂，是一种安全、高效的生物源防霉剂，在粮食的天然保鲜、防霉等方面具有重要的开发价值。

2.3.2 生物源防霉剂——动物源

和植物源防霉剂相比，动物源防霉剂研究相对较少。近些年，昆虫抗菌肽、壳聚糖以及鱼精蛋白为主要研究对象。吕丁丁等[38]对家蚕抗菌肽抑制细菌的作用机理进行研究。发现家蚕抗菌肽具有穿透细胞膜功能，并与DNA和RNA相互作用，致使细菌死亡。另外对壳聚糖及其盐类物质的抑菌效果进行研究，研究发现壳聚糖盐类物质的抑菌效果明显高于壳聚糖。将壳聚糖与金属离子Cu、Zn等复合，对壳聚糖的抑菌效果明显提高，当质量分数为20.0 g/kg时，抑菌效果最佳[39]。壳聚糖是一种天然化合物，无毒副作用，将其与金属离子复合，形成壳聚糖盐，在食品、医疗等行业具有潜在的应用价值。

以上三类防霉剂各有优缺点(表1)，目前，仍处于不断的探索和研究中。从物理防霉剂到生物源防霉剂，不同来源的防霉剂在不断地被挖掘，以期达到广谱高效、安全低毒的目的。

表1 三类防霉剂在应用过程中的优势和不足

3 防霉剂效果评价方法

防霉剂防霉效果的评价方法较多，主要有两个方面：一是防霉剂的抑菌效果，通常是让防霉剂只作用于菌体，确定其是否具有抑菌功能；二是以粮食为载体进行的防霉效力测定，主要是检测防霉剂在模拟或实际储粮过程中，对霉菌的抑制效果。目前，常见的评价方法有以下几种。

3.1 防霉剂抑菌效果分析

3.1.1 抑菌圈法

抑菌圈法是指防霉剂点接在培养霉菌的琼脂平板上，使其周围的菌落生长受到抑制而形成透明圈，即抑菌圈。抑菌圈法是一种初步评价方法，通常用来判断某种物质是否具有抑菌效果或比较几种物质的抑菌效果强弱[37]。在进行抑菌实验时，由于抑菌圈的大小受防霉剂种类、培养基成分、培养温度等因素的影响，因此选择适当的条件，是抑菌实验成功的关键[40]。 抑菌圈法操作方便，通过比较抑菌圈直径大小可知抑菌效果，是防霉剂效力的初步检测方法。

3.1.2 最低抑菌浓度

最低抑菌浓度法是一种定量方法，能够较为精确地测定防霉剂的抑菌能力。抑菌测定的方式可采用固体培养基，也可以在液体培养基中进行，但对抑菌程度的评价方法不一。最低抑菌浓度一般是指在某一浓度下，无菌生长，则该浓度为最低抑制浓度。但也有学者认为最低抑制浓度是当抑菌剂对菌丝生长抑制率为50%时，该浓度为最低抑制浓度[41]。在实际操作过程中，通常采用菌落数、OD值和革兰氏染色等方法来判断最低抑菌浓度[42-44]，由于最低抑菌浓度在测定过程中受到接菌量、培养环境以及培养基等条件的影响，因此在利用最低抑菌浓度法评估防霉剂的抑菌效果时，建议至少三次重复实验和三组平行实验，以达到较为稳定的数据结果。

3.1.3 最低杀菌浓度

为了更为精准地评价防霉剂的抑菌效果，常对防霉剂的最低杀菌浓度进行测定。目前，研究者主要在两个方面对最低杀菌浓度进行测定。一是将不同浓度的防霉剂和含有霉菌孢子的培养基混合，当孢子的致死率达到99.9%以上，该浓度为最低杀菌浓度[45]。二是在最低抑菌浓度的基础上，增大抑菌剂浓度，延长培养时间，若无菌落生长，则为最低杀菌浓度[46]。最低杀菌浓度对孢子的致死率要求很高，但霉菌孢子的数量、培养基pH等因素对准确率会有影响。因而要求在比较防霉剂的最低杀菌浓度时，实验条件要保持一致。

3.2 防霉剂在粮食中防霉效果的检测方法

防霉剂效果的评价通常先进行防霉剂的抑菌效果的初步评价，再对防霉剂在粮食中的防霉效果进行检测。粮食防霉效果评估主要考察籽粒的菌相、菌量、萌发率、营养成分、相关酶活性等指标。在储藏过程中，粮食籽粒的质量、初始菌相菌量、防霉剂的投放方式、温湿度等均会影响防霉剂的防霉效果。模拟储藏条件下，若采用粮食接种目标霉菌来测定防霉效果，还需先对粮食籽粒进行无菌处理，目前常采用的方法有：1)NaClO4或酒精进行表面消毒；2)γ射线进行完全灭菌[10]。另外，防霉剂运用于实际储粮是防霉效果评价的最后环节，也是极为重要的一步，可以反映真实的储粮条件下防霉剂的防霉效果。

在防霉剂效果评价过程中，一些学者选择细菌作为抑菌对象，虽然能够验证该物质具有抑菌能力，但在粮食储藏中，影响粮食品质的主要为霉菌，防霉剂对细菌的抑制，不能反映出对霉菌也有很好的抑制效果。因此，防霉效果评价时要注意抑菌对象的选择对实验结果的影响。

4 展望

国内外关于粮食防霉剂的研究报道均表明，精油具有绿色、安全、高效等特点，对粮食中黄曲霉和青霉菌等具有较强的抑制效果，且对黄曲霉毒素、呕吐毒素等毒素的合成有抑制作用，是一种较为理想的粮食防霉剂，在粮食储藏中具有良好的应用前景。然而在实际生产使用过程中，面临着诸如提取成本高、应用工艺尚未成熟等问题，阻碍了在粮食储藏中的应用。植物源防霉剂若要在粮食储藏中得以广泛应用，还需要进行改进和优化：1)精油中的柠檬醛、肉桂醛、丁香酚等成分是影响抑制霉菌生长的主要成分，可以通过人工化学合成的方法，降低提取成本。但某些成分存在异构现象如柠檬醛、肉桂醛，天然存在时只为其中的一种构型(反式)，而在化学合成过程中，易产生对应的异构体(顺式)，降低了有效成分的产率。所以，还需对反式柠檬醛、反式肉桂醛等物质合成工艺进行探索和研究，提高单一目标成分，减少异构体。2)在在应用时，精油除了可以利用粮仓已有的环流熏蒸管道进行短时间高浓度熏蒸外，也可以制成微胶囊、脂质体等缓释产品，增加精油释放的稳定性、延长其释放时间，达到长期防霉效果。为了提高缓释产品包埋率，仍需要进一步优化包埋工艺。如采用冷冻干燥法来增大精油乳液颗粒的表面积等。3)大都数精油都具有强烈的刺激性气味，如肉桂精油、牛至精油等，导致粮食也具有一定的气味，降低粮食及其副产品的使用价值。因此，如何将精油中的刺激性气味去除，同时不影响防霉效果，仍需要进一步探究。