酶法辅助提取小米多酚的工艺研究

魏春红 何丽娜 丁闻浩 鹿保鑫 曹龙奎

(黑龙江八一农垦大学食品学院1，大庆 163319)(国家杂粮工程技术研究中心2，大庆 163319)

小米(Setariaitalica)，亦称作谷子，是一类小种可食用禾本科植物的总称，主要种植于干燥带边缘、温带、亚热带和热带地区，是全球第六大重要谷物[1]。小米是我国一种主要食用的杂粮，产于东北、华北地区。小米富含蛋白质、氨基酸、维生素及优质的不饱和脂肪酸，具有防止动脉硬化、减少心脑血管疾病、降血压和抗癌等重要作用[2]，这些功能主要是由许多微量营养元素和小米中的植物化学物质，包括抗性淀粉、抗氧化剂如酚酸和类黄酮，以及激素活性化合物，如木脂素和植物甾醇[3]，相比于其他的杂粮物质，小米中多酚的含量与种类更加的丰富[4]。

近年来，多酚类物质成为国内外食品界研究的重点之一，大量的实验与研究表明多酚类物质具有独特的生理功效与药用价值，市场前景广阔。其可以广泛应用于食品的抗氧化、防腐与澄清等方面；在农业生产中，可与多种微量元素螯合物处理苹果树和银杏树，使苹果增产19.8%～25.4%，银杏叶增产25.5%[5]；而在医药领域，还可作为抗菌、抗病毒、抗癌的天然药物[6]。尽管多酚有诸多作用，但国内多酚的提取率相对较低[7]，而且提取方法的差异对提取率的影响非常大。为了有效获取小米中的多酚，研究者们已通过多种途径提取。最常用的方法是溶剂提取法[8]，此法处理时间长、提取效率低，虽然通过一些辅助的提取方法如微波[9]、超声波[10]等可以适当的提高多酚的得率[11-12]，但始终无法避免大量有机试剂如乙醇的使用，造成了不可避免的环境污染和能源浪费。近几年，一些研究人员利用酶法来辅助多酚的提取，取得了理想的效果[13-15]，如利用木瓜蛋白酶酶解核桃粕蛋白产物[16]，利用α-淀粉酶水解制备银杏抗性淀粉[17]。与其他方法相比，酶处理方法具有快速、高效、温和、专一性强等诸多优点，并且在成本和使用上更加简便，对设备和工艺的要求也较少[18]。但目前，利用酶法提取小米多酚还鲜见报道。

本研究利用小米作为原料，采取单因素与响应面为研究手段，将酶法引入到小米中多酚的提取工艺中，以期提高小米中多酚的得率，为小米资源的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料

武安小米：产于河北省邯郸市武安市，蛋白质质量分数约为9.2%～14.3%，粗脂肪质量分数3.0%～4.6%。

没食子酸：上海一研生物科技有限公司；福林酚：北京华迈科生物技术有限责任公司；木瓜蛋白酶(6 000 U/g)：滕州市天水生物科技有限公司；α-淀粉酶(40 000 U/g)：邢台万达生物工程有限公司；DPPH、TPTZ：美国Sigma公司。

1.2 主要仪器设备

WKF-20BZ高速万能粉碎机：北京格瑞德曼仪器设备有限公司； SP-752/752PC紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司； CTK120C离心机：湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶法辅助提取工艺流程及操作要点

小米→40 ℃烘箱处理5 h→粉碎筛分→称取定量样品按0.8%添加酶液→设定酶解条件→过滤→离心→上清液→定容→检测多酚含量。

将小米去杂、磨碎、过筛，准确称取一定量的小米粉，加入石油醚索式抽提得到小米脱脂产物，4 ℃下储藏备用。精密称取一定质量脱脂小米粉放入锥形瓶中，调整其pH至5.0，随后加入1%的木瓜蛋白酶与α-淀粉酶，二者比例为1∶1(m/m)，分别调整不同的酶的添加量、酶解时间跟酶解温度，过滤，收集滤液，将滤液离心得到上清液，减压蒸馏得到浓缩液，取浓缩液1 mL定容至10 mL，测吸光度并计算多酚得率。

1.3.2 多酚含量测定方法

1.3.2.1 总酚标准曲线绘制

精确称取没食子酸标准品25 mg，去离子水溶解后定容于250 mL容量瓶中，得0.1 mg/mL的对照品标准溶液。精密吸取对照样品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于10 mL容量瓶中，再加入1 mL Folin-Cio-calteau试剂，摇匀后加入2 mL 15%Na2CO3溶液定容10 mL，常温下让其反应2 h，在760 nm处测定其吸光值。得回归方程为：y=12.861x+0.0829，R2=0.999 0。Y为吸光度值，X为没食子酸含量(mg)。

1.3.2.2 总多酚含量的测定

以Foiri-Ciocalteu法[19]测定总多酚含量，以没食子酸作为标准物。

用移液枪移取1mL待测样品，添加Foiri-Ciocalteu溶液，随后，添加2 mL 15%的Na2CO3溶液，将其充分摇匀后，常温放置2 h，随后在760 nm处测定其吸光值。

1.3.3 抗氧化性测定

1.3.3.1 DPPH自由基消除能力测定

取0.5 mL样品，加入2.5 mL含100 μmol/L DPPH的乙醇溶液，混匀，室温放置30 min后，5 000 r/min离心5 min，在517 nm处测定吸光值(A样)，以5 000 r/min离心5 min过后的上清液调仪器零点；同时检测2.5 mL含 100 μmol/L DPPH 的乙醇溶液与0.5 mL蒸馏水的吸光值(A0)。对DPPH自由基的清除率=[(A0-A样)/A0]×100%。

1.3.3.2 FRAP法测定抗氧化能力

配制不同质量浓度的FeSO4溶液50 μL，各加入3.0 mL TPTZ工作液，37 ℃水浴30 min，测定595 nm处的吸光度。以蒸馏水为空白样调零。以吸光度为纵坐标，FeSO4质量浓度为横坐标绘制标准曲线。取1.0 mL样品，以蒸馏水定容到10 mL，准确吸取稀释液50 μL，加入3.0 mL TPTZ工作液，37 ℃水浴30 min，测定595 nm处的吸光度。抗氧化能力用FeSO4标准溶液的浓度来表示。

1.3.4 单因素实验

为获得小米中的多酚含量，分别对液料比10 ∶1、12∶1、14∶1、16∶1、18∶1(V/m)、双酶添加量为0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%，酶解时间1、1.5、2、2.5、3 h，酶解温度20、30、40、50、60 ℃做单因素实验，以确定各因素的最佳水平。

1.3.5 响应面优化工艺参数

为了确定最优酶法辅助提取小米多酚工艺条件，以单因素实验为基础，利用响应曲面法对其进行优化处理，即以液料比、双酶添加量、酶解时间、酶解温度为自变量，多酚得率为响应值，设计四因素三水平优化实验。其实验因素水平如表1所示。

表1 Box-Behnken 实验因素水平表

1.4 数据处理

所有数据通过3次测定后取得平均值，用Origin9.1作图，SPSS V19.0分析其显著性，响应面分析采用Box-Behnken模型。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 液料比对小米多酚得率的影响

由图1可见，随着料液比的不断上升，小米中的多酚得率呈现出先快速上升，后缓慢下降的趋势。在液料比为14∶1时，其多酚的得率最高，为4.80 mg/g。这是因为伴随着液料比的不断增加，溶剂和小米之间的接触面增大，从而有利于小米多酚的溶出[20]，但当液料比的比值过高时，由于酶与底物的接触会由于稀释过度而受限，酶的作用受到抑制，进而影响了多酚的提取率。不仅如此，过大的料液比在实际的生产过程中不仅增加了水的消耗，并且增加后续的浓缩成本，对后续加工造成困难因此，选择液料比为14∶1做为最适宜液料比。

2.1.2 双酶添加量对小米多酚得率的影响

从图1中可以发现，随着复合酶用量增加，多酚含量明显上升。这是因为淀粉酶在适宜的介质中可以水解小米中的淀粉，有助于与淀粉结合的部分多酚释放，这与吕俊丽等[21]研究莜麦中多酚的提取的结果相一致，但当双酶的添加量超过0.9%时，多酚的含量却呈现出下降的趋势。虽然适量木瓜蛋白酶可以通过破壁改变细胞壁的通透性，使得细胞壁破裂增加有效成分的溶出，提高多酚的提取率，但是多酚的分子可以与蛋白质和氨基酸发生很强的络合反应，而酶是具有催化活性的蛋白质，当酶过量时就会与多酚络合[22]，而且当继续增加酶量，酶与底物的接触面积过剩，会降低反应速率，不仅总酚溶出会降低，而且会增加投入，进而减少了溶液中可提取的多酚的含量。

2.1.3 酶解时间对小米多酚得率的影响

从图1能发现，伴随着酶解时间的不断延长，小米多酚得率也不断的上升，在2 h时便达到最大值，随着酶解时间的继续延长，其多酚得率趋于稳定。这是由于随着酶解时间的不断变化，小米细胞壁与细胞间层的纤维素的隔层被有效破坏，多酚便可以更容易地从细胞内流出，但当达到适宜的时间后，其多酚类物质在细胞内外处于平衡的状态，更长的酶解时间对其作用影响不大，反而会由于更长时间的酶解使得小米中的多酚产生不必要的损失，甚至于发生氧化反应，导致酚类的含量有所降低[23]。因此，考虑到时间与生产成本等因素，选择酶解时间2 h为宜。

2.1.4 酶解温度对小米多酚得率的影响

图1中，在适宜的温度范围内，温度升高，小麦中多酚得率也有所增加，在40 ℃ 时其多酚的得率达到了最大值。这是因为：一方面木瓜蛋白酶与α-淀粉酶酶解活力随温度升高而增强，使反应速率加快；另一方面，在加热过程中，淀粉本身可发生膨胀并释放直链淀粉，随着加热的进行，淀粉颗粒破裂，使得多酚物质得以从笼形包含物中释放出来，因此，多酚得率随之增加[24]。有研究表明，酶解作用是促进小麦粉中多酚释放的主要原因[25]。当温度进一步提高过程中，多酚得率反而降低。这是因为温度持续升高，导致酶活力减弱，稳定性降低，且高温还可能会破坏已提取出来的多酚结构[10]，故选取40 ℃为最佳酶解温度。

图1 液料比、复合酶用量、 酶解时间、 酶解温度对小米多酚得率的影响

2.2 响应面法对小米多酚提取工艺的优化

在单因素实验的基础上，选取液料比、双酶添加量、酶解时间、酶解温度为4个影响因素，将响应R值确定为多酚得率，其实验方案与设计见表2。

表2 实验方案及结果

通过统计分析软件Design-Expert进行数据分析，得到关于R的方程为：

R=4.81+0.045A+0.043B-0.022C-5.833E-003D+0.13AB+0.022AC+2.500E-003AD+0.040BC-0.14BD+5.000E-003CD-0.98A2-0.70B2-0.54C2-0.41D2

表3 方差分析

由回归系数的显著性检验可知，液料比与双酶添加量、双酶添加量与酶解温度的交互作用达到显著水平(P<0.05)。响应面越陡，各因素之间的两两交互作用越显著。液料比在 13∶1～15∶1、 双酶添加量0.8%～1%的范围内存在极值，即两者之间存在较好的交互作用。在液料比为13∶1～14∶1之间时，随着双酶添加量的增大，总多酚得率增加，在液料比为14∶1～15∶1之间时，随着双酶添加量的增大，总多酚得率减少。双酶添加量在0.8%～1.0%，酶解温度在39～41 ℃之间存在极值，在双酶添加量0.8%～0.9%之间，随着酶解温度的增加，总多酚得率增加，在双酶添加量0.9%～1.0%之间，随着酶解温度的增加，总多酚得率降低。

通过模型得到的结果为：液料比为14.05∶1、双酶添加量为0.91%、酶解时间为1.99 h、酶解温度为39.94 ℃，所能提取到的多酚得率为4.81 mg/g。结合实际生产中的工艺水平，调整到：液料比为14∶1、双酶添加量为0.9%、酶解时间为2 h、酶解温度为40 ℃。

为了验证更为可靠的数据，采用工艺条件进行3次实际提取，结果见表5，所得到的多酚得率平均值为4.83 mg/g，与理论预测值相差0.02 mg/g。所以，通过本方法优化的工艺条件准确可靠。

由表4对比实验结果可知，在不加酶条件下提取小米中多酚得率为3.95 mg/g，比加酶提取工艺低0.88 mg/g。由此可见，在小米多酚的提取工艺中，通过添加木瓜蛋白酶与α-淀粉酶可以调高小米多酚的含量。

表4 验证和对比实验结果

2.3 抗氧化能力的对比

由表5可见，在木瓜蛋白酶与α-淀粉酶作用后，样品的自由基消除能力有所增加，从未处理样品的76.51%提高到83.42%，提升了9.03%，抗氧化能力也有所提高，未处理样品为2.96，处理后样品为3.67，提升力23.99%，因此，通过双酶法提取小米多酚不仅可以提升其多酚的含量，也可以提升小米的抗氧化能力。

表5 抗氧化能力的对比

3 结论

以单因素实验为基础，考察了液料比、双酶添加量、酶解时间、酶解温度对小米多酚得率的影响。由响应面分析实验得出，液料比、双酶添加量是影响小米多酚得率的主要因素，其中液料比的影响最为显著。通过回归分析确定小米多酚提取的最佳工艺液料比为14∶1、双酶添加量为0.9%、酶解时间为2 h、酶解温度为40 ℃。这种处理条件下，小米多酚得率可达4.83 mg/g，比未添加酶处理的样品高0.95 mg/g。不仅如此，还可以提升小米的抗氧化能力。由验证实验结果可以发现，利用响应曲面优化小米多酚的提取工艺条件在实践上具有可操作性。而酶法辅助提取小米多酚具有条件简便、耗时较短、反应条件温和、经济成本低与高效率的优势，其研究价值值得肯定。