与多形性胶质母细胞瘤患者生存期相关的权重基因共表达网络构建

徐晓文 何玉琪 张 露 潘名志 杨旭娜 惠 李 谷晓楚

1.江苏省苏州市广济医院临床检验科，江苏苏州 215008；2.江苏省苏州市广济医院医务部，江苏苏州 215008；3.江苏省苏州市广济医院科教部，江苏苏州 215008

胶质瘤是一种起源于神经胶质细胞的恶性肿瘤，是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤[1]。根据病理评估，WHO将胶质瘤分为低级别和高级别两类，其中低级别胶质瘤分化良好、多为良性、预后较好；而高级别胶质瘤为未分化、恶性、预后较差，如多形性胶质母细胞瘤中位生存时间约为15个月[1]。癌症和肿瘤基因图谱数据库（The Cancer Genome Atlas，TCGA）是目前全球最大的癌症基因信息数据库，提供不同种类癌症基因突变、表达和甲基化等信息以及患者临床资料，这为采用系统生物学方法研究肿瘤发生发展、识别决定多形性胶质母细胞瘤患者预后的关键因素提供了研究资料[2]。本研究采用权重基因共表达网络（Weighted Gene Co-Expression Network，WGCNA）分析构建了多形性胶质母细胞瘤权重基因共表达网络，并与患者生存期进行相关性分析，筛选出与生存期显著相关的共表达模块，并进一步利用通路富集分析软件对模块中的基因进行通路分析，从而为多形性胶质母细胞瘤临床治疗提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究纳入的胶质瘤患者临床资料和胶质瘤组织RNA测序数据全部从TCGA数据库获得。TCGA数据库共收录了148例多形性胶质母细胞瘤样本表达谱数据，其中男95例，女53例；确诊年龄（60.0±13.5）岁，平均生存期12.4个月。

1.2 数据预处理

共注释得到了20 029种RNA表达量。为了减少计算量，排除了在少于20%的个体中表达的基因。通过预处理，保留了16 664个基因转录本。采用R软件平台的 DESEQ 包对这些RNA测序数据进行均一化处理。

1.3 共表达网络构建

将均一化后的表达数据以及临床资料导入R软件平台，采用WGCNA软件包构建多形性胶质母细胞瘤组织的权重基因共表达网络。

1.4 共表达网络与临床资料相关性分析

将获得的权重基因共表达网络与患者生存期进行相关性分析，筛选出与生存期强相关的共表达模块。

1.5 通路分析

将筛选出模块中的基因导入通路富集分析软件Consensus Path DB（http://consensuspath-db.org）在线进行通路分析。

2 结果

2.1 共表达网络构建

基于胶质瘤组织RNA测序数据构建的权重基因共表达网络共包括31个共表达模块，处于同一个模块中的基因具有类似表达模式（见图1）。

图1 基于胶质瘤组织RNA测序数据构建的权重基因共表达网络

2.2 不同共表达模块与患者生存期相关性

暗宝石绿模块与多形性胶质母细胞瘤患者生存期显著相关（r=0.35，P＜0.01）。见图2。在WGCNA中，特定基因表达量与临床资料之间的相关性被定义为基因显著性（Gene significance），而特定基因与模块特征基因之间表达量上的相关性被定义为模块身份（Module membership）。在暗宝石绿模块中，基因显著性与模块身份显著相关（r=0.44，P＜0.01）表明与多形性胶质母细胞瘤患者生存期显著相关的基因也是该模块的核心成员。见图3。

图2 共表达网络模块与多形性胶质母细胞瘤患者临床资料的相关性分析

图3 暗宝石绿颜色模块中199个基因的基因显著性与模块身份的相关性分析

2.3 通路分析

199个基因主要富集于整合素、胶原蛋白、硫酸软骨素等细胞外基质相关通路以及Wnt、表皮生长因子受体（EGFR）、血管内皮生长因子（VEGF）、尿激酶型纤溶酶原激活因子（uPA）和伊立替康等代谢相关通路中。

3 讨论

在本研究中，我们基于TCGA数据库中的多形性胶质母细胞瘤RNA表达谱数据构建了权重基因共表达网络，并将获得的31个共表达模块与多形性胶质母细胞瘤患者生存期进行相关分析，其中一个与生存期强相关的暗宝石绿模块中的199个基因显著富集于整合素、胶原蛋白、硫酸软骨素等细胞外基质相关通路以及Wnt、EGFR、VEGF、uPA和伊立替康代谢等相关通路中。

胶质瘤细胞多数呈现特殊的侵袭浸润生长方式，是脑胶质瘤显著的病理学特征[1]。大量研究发现，有很多因子参与了胶质瘤细胞侵袭和浸润，如VEGF、uPA、整合素、硫酸软骨素等[3-5]。胶质母细胞瘤能够自分泌VEGF，促进肿瘤组织血管形成，从而更高效地向正常组织扩散，维持肿瘤组织内部环境稳态[6]。uPA表达于胶质瘤组织边缘，与胶质瘤侵袭性密切相关，敲除uPA基因的胶质瘤细胞会丧失侵袭性[7]。整合素也是肿瘤侵袭生长的关键因素，其通过与细胞外基质成分胶原、硫酸软骨素等相互作用，以及细胞间黏附和信号传导，促进肿瘤生长、分化和转移[8]。

Wnt信号通路是一条高度保守的通路，参与调节包括胚胎器官发育在内的多种过程，包括增殖、分化、凋亡等多种细胞生物学行为[9]。在脑胶质瘤病理过程中，Wnt信号通路与胶质瘤恶性程度相关，并发挥多方面功能：如上调VEGF表达，从而促进肿瘤组织血管生成；促进胶质瘤侵袭生长，敲除Wnt1和Wnt3a能够抑制胶质瘤细胞增殖和迁移；抑制胶质瘤细胞凋亡，下调beta-catenin水平可以诱导胶质瘤细胞凋亡[10-12]。

EGFR是一种重要的原癌基因，是人表皮生长因子受体家族成员，具有酪氨酸激酶活性，可促进细胞分裂和增殖，参与肿瘤细胞增殖、粘附、新生血管形成、侵袭与转移，并可抑制肿瘤细胞凋亡[13-14]。在胶质瘤患者中，约50%会出现EGFR扩增、重排、突变和过表达，导致胶质瘤细胞异常增殖，且与胶质瘤分级、恶性程度等呈正相关[15]。针对EGFR的靶向治疗可能成为胶质瘤治疗的新方向[16]。

伊立替康作为一种拓扑异构酶I抑制剂，具有广泛抗肿瘤活性，临床主要用于结直肠癌、小细胞肺癌及卵巢癌等治疗[17]。因伊立替康可透过血脑屏障，对中枢神经系统肿瘤具有较强的细胞毒性，因此在脑胶质瘤治疗领域具有一定潜力[18]。但伊立替康单药治疗胶质瘤疗效不甚理想，且易出现耐药现象[19]；与替莫唑胺、塞来昔布、舒尼替尼及贝伐单抗等联用则显示出较好抗肿瘤活性，提高康复率、延长无进展生存期。

由于样本收集困难，本研究未采用平行对照来验证生物信息学分析获得的结果，这是本研究的不足。但作为探索性研究，我们仍然取得了一些有意义的结果。本研究利用生物信息学工具对组学研究筛选出的基因集进行深入分析，初步确定了与多形性胶质母细胞瘤患者生存期相关的生物学过程及信号通路，并为今后多形性胶质母细胞瘤研究和临床诊治提供了一些思路和启发。