粉末X射线衍射技术定量分析左炔诺孕酮晶型*

邢逞，曹俊姿，张丽，龚宁波，杨世颖，杜冠华，吕扬

(中国医学科学院北京协和医学院药物研究所1.晶型药物研究北京市重点实验室；2.药物靶点研究与新药筛选北京市重点实验室，北京 100050)

左炔诺孕酮(levonorgestrel)是一种速效、短效口服避孕药，可以抑制排卵并阻止孕卵着床，同时使宫颈黏液浓度增大，阻止精子前进[1]，从而达到避孕的目的，是目前国内外应用最广泛的紧急避孕固体药物。除用于紧急避孕之外，左炔诺孕酮还被报道用于乳腺癌患者子宫内膜的保护[2]和子宫内膜异位症的囊肿治疗[3]。目前该药物及其制剂收载于《中华人民共和国药典》2015年版二部[4]。左炔诺孕酮存在多晶型现象，目前国内外已有文献专利报道左炔诺孕酮存在3种晶型物质，包括晶α型、晶β型、晶γ型[5-9]，其中晶γ型为临床药用晶型，鉴于左炔诺孕酮3种晶型在一定条件下会互相转化，且左炔诺孕酮药物的质量标准中未涉及晶型质控问题，故笔者对左炔诺孕酮的临床药用晶型开展定量分析研究[10-11]。

美国食品药品管理局针对仿制药的研发趋势，发布了《仿制药晶型研究的技术指导原则》[12]。提出了评价建立多晶型质量标准的必要性，也为原料药多晶型和药物制剂多晶型质量标准的建立提供了指导性建议。目前，国内外报道的药物晶型定量分析方法主要有粉末X射线衍射(powder X-ray diffraction，PXRD)法[13]、差示扫描量热法[14]、固态核磁共振法、傅里叶变换红外光谱法等。其中PXRD法是最经典、非破坏性、较准确的晶型定量方法，且PXRD法现已广泛应用于晶型的定量分析和结晶度的测定，目前已纳入到《中华人民共和国药典》2015年版四部通则“药品晶型研究及晶型质量控制指导原则”[4]中。PXRD法定量分析的理论基础是物质参与衍射的体积或重量与其产生的衍射强度成正比。因而，可以通过衍射强度的大小求出参与衍射的体积或质量[15-16]。

通过对市售左炔诺孕酮原料药及制剂进行晶型鉴别及重现专利晶型的制备方法确证了目前左炔诺孕酮的临床药用晶型为晶γ型。采用单晶X射线衍射法(single crystal X-ray diffraction method，SXRD)技术方法获得了晶γ型纯品的定量数据，通过理论计算获得其晶态晶型纯度为100%的样品标准PXRD数据；采用PXRD法分析制备的左炔诺孕酮晶γ型，发现其粉末X射线衍射图谱与PXRD图谱一致，表明实验制备的粉末样品为左炔诺孕酮晶γ型纯品；采用PXRD分析技术建立了左炔诺孕酮晶γ型的晶型含量定量检测方法，该方法制样简便，分析快速，对样品无破坏性，晶型含量测定准确可靠，研究结果对左炔诺孕酮的晶型质量控制提供了有效分析技术方法和科学数据。

1 仪器与试药

1.1仪器与实验条件

1.1.1SXRD法 日本理学Rigaku MicroMax 002+单晶X射线衍射仪。实验条件为采用CuKα辐射(1.54187 Å)，共聚焦单色器，准直光管直径ф=0.30 mm，晶体与CCD探测器距离d=45 mm，管压45 kV，管流0.88 mA。结构解析和结构精修采用Shelxs-97完成。

1.1.2PXRD法 日本理学Rigaku D/max-2550 PXRD仪。实验条件为采用石墨单色器，CuKα辐射(1.54184 Å)，管压为40 kV，管流为150 mA，扫描步长为0.02°，扫描速度为8°·min-1，发散狭缝为1°，接收狭缝为0.15 mm，防散射狭缝为1°，扫描范围为3°～80°。实验样品均经研磨，并过100目筛，精密称量后进行检测。

1.1.3天平 瑞士梅特勒公司XS105型分析用，感量0.01 mg。

1.2试药 左炔诺孕酮原料样品购于南京康满林化工实业有限公司和武汉远成共创科技有限公司，化学纯度均>99.0%。其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1晶型样品制备

2.1.1晶γ型单晶培养 采用甲醇-四氢呋喃(0.5：1)重结晶，室温约25 ℃条件下静置6 d，得到无色透明块状晶体。

2.1.2晶γ型样品制备 取左炔诺孕酮原料药样品1 g，加入乙醇125 mL，溶解完全后于室温重结晶，40 ℃减压干燥2 h，得到白色粉末状样品。

2.2晶型确证

2.2.1SXRD法 采用SXRD法获得左炔诺孕酮晶γ型的晶体学数据，晶体属正交晶系，空间群为P212121，晶胞参数：a=6.581(3)Å，b=12.812(3)Å，c=20.680(5)Å，晶胞体积V=1 743.7(10)Å3，晶胞内分子数Z=4。左炔诺孕酮晶γ型的立体结构投影图和晶胞堆积图见图1。

图1晶γ型的立体结构投影图(A)和晶胞堆积图(B)

Fig.1ORTEPdiagram(A)andpackingimage(B)oflevonorgestrelformγ

左炔诺孕酮化合物分子骨架由3个六元环和1个五元环构成。晶态下分子内不存在氢键联系，分子间的氢键联系为O2…O1(-x+1/2，-y，z+1/2)：2.933Å。晶态下分子以氢键作用力和范德华力维系其在空间的稳定排列。SXRD法研究使用一颗单晶体，故该研究数据，结果能体现该种晶型样品100%晶型纯度结果。

2.2.2PXRD法 利用左炔诺孕酮的晶γ型样品的SXRD数据，通过理论计算可获得晶型纯品的理论PXRD图谱。左炔诺孕酮晶γ型的理论和实验PXRD图谱见图2。左炔诺孕酮晶γ型前10位主强峰比对数据见表1。

图2左炔诺孕酮晶γ型粉末X射线衍射图谱

Fig.2PXRDpatternsoflevonorgestrelformγ

采用PXRD法对制备的左炔诺孕酮晶型样品分析，结果发现，左炔诺孕酮晶γ型的PXRD图谱数据实验值与理论数据一致，表明实验制备的粉末样品为晶γ型纯品。

2.3定量分析

2.3.1特征衍射峰的选取及专属性研究 按照PXRD定量分析的特征峰选取原则：①选取目标成分具有特征性的独立衍射峰；②特征衍射峰的绝对强度应与目标成分含量呈线性关系；③强度较高的衍射峰应优先选择。预选取了左炔诺孕酮晶γ型6个衍射峰(d=5.6，6.1，6.4，4.5，4.2和3.8 Å)作为定量分析的特征峰，见图3。

表1 左炔诺孕酮晶γ型理论与实验PXRD图谱前10位主强峰数据对比

图3左炔诺孕酮晶γ型的PXRD图谱(3°～40°)

Fig.3PXRDpatternsoflevonorgestrelformγ(3°-40°)

2.3.2线性与范围 精密称取左炔诺孕酮晶γ型样品5，10，15，20，25，30，35，40，45，50 mg，每种质量样品平行制备2组，对实验样品进行PXRD分析。晶γ型的6个特征衍射峰绝对强度(CPS)见表2。

以晶γ型质量为横坐标，以d=6.4，6.1，5.6，4.5，4.2，3.8Å处衍射峰的绝对峰强度平均值为纵坐标，依次绘制标准曲线，获得线性方程分别为Y=459.59X+5 536.5(R2=0.993 0)、Y=432.58X+6 827.6(R2=0.990 9)、Y=615.95X+6 209.5(R2=0.990 8)、Y=232.61X+4 118.7(R2=0.961 7)、Y=189.31X+3776.1(R2=0.949 0)、Y=126.79X+2 738.4(R2=0.929 4)，线性范围均为5～50 mg。

分析结果表明，左炔诺孕酮晶γ型6个特征衍射峰中的d=6.4，6.1，5.6 Å的绝对强度与质量间呈现良好的线性关系(R2>0.99)，因此d=6.4，6.1，5.6 Å的3个衍射峰均可作为其含量测定的特征峰使用，所建立的标准曲线可实现对晶型原料药质量控制目的。

2.3.3中间精密度(仪器精密度) 精密称取左炔诺孕酮晶γ型样品50 mg，共1份，进行PXRD分析，测定6次，考察d=6.4，6.1，5.6 Å处衍射峰绝对峰强时精密度，RSD值分别为0.86%，0.75%，0.96%，均<2.0%，表明利用PXRD测定左炔诺孕酮晶γ型含量的检测分析方法具有良好的中间精密度。

表2 PXRD法测定晶γ型结果

2.3.4重复性实验 精密称取左炔诺孕酮晶γ型样品50 mg，共6份，分别测定1次，考察检测方法的精密度，计算获得6份样品在d=6.4，6.1，5.6 Å处绝对峰强的RSD值分别为1.25%，1.45%，1.76%，均<2.0%，表明利用PXRD测定左炔诺孕酮晶γ型含量的检测分析方法具有良好的重复性。

2.3.5样品测定 分别取厂家1与厂家2的左炔诺孕酮原料药，过孔径0.150 mm(100目)筛，精密称取50 mg各3份，在相同的测试条件下测定PXRD图谱，记录d=6.4，6.1，5.6 Å的特征衍射峰的绝对强度值，分别代入回归线性方程，计算左炔诺孕酮样品中晶γ型质量平均值分别为49.8和50.0 mg，含量分别为99.6%和100%。表明市售的厂家1与厂家2的左炔诺孕酮原料药为晶γ型纯品。

3 讨论

笔者在对左炔诺孕酮市场应用现状的调研以及其多晶型考察中发现，左炔诺孕酮3种晶型物质中晶γ型为临床使用的药用晶型。故采用PXRD分析的单峰法为左炔诺孕酮的原料药建立晶型定量分析方法。单峰法灵敏度较高，方法简单便捷，但是该方法需要标准品，或者要求标样具有较高的晶型纯度，而且制样时产生的择优取向效应会严重影响单峰法的应用。根据左炔诺孕酮晶γ型的晶体学数据，计算出的理论PXRD图谱数据与实验粉末完全吻合，表明制备的粉末样品为晶γ型纯品，可作为标准样品使用。制样时，统一将样品研磨过孔径0.150 mm(100目)筛，减少择优取向效应对峰强度值的干扰。

利用PXRD法建立的定量分析方法，线性关系良好，且具有良好的中间精密度和重复性。此方法的建立可以实现对左炔诺孕酮原料药中晶型成分进行质量控制，为提高现有左炔诺孕酮药品标准，加强药品晶型控制，完善晶型含量检测方法提供了基础科学数据和技术支持，满足我国各制药企业左炔诺孕酮原料药生产过程中的晶型质量控制要求。