正相柱色谱法分离制备陈皮中橘皮素和川陈皮素

吕小健，许 引，徐兰英，李士明，龙 涛*，王运利

（1.武汉纺织大学 化学与化工学院，湖北 武汉 430200；2.黄冈师范学院 化学化工学院 催化材料制备及应用湖北省重点实验室，湖北 黄冈 438000）

陈皮又称橘皮、广陈皮，为芸香科植物橘及其栽培变种的成熟果皮，是一种药食同源的中药，有理气调中，燥湿化痰功效[1-3]。已有研究表明，陈皮中特有的黄酮类化合物具有抗氧化[4-6]、抗炎[7-9]、抗癌[10-12]、抗菌[13]、保肝作用[14]、保护心脑血管系统[15]等生理活性。橘皮素和川陈皮素均为多甲氧基黄酮类化合物，属于陈皮中的特有黄酮，对陈皮的生物活性起到了重要作用，其化学结构式见图1。

川陈皮素能通过抑制肝脏脂肪酸生物合成和增加脂肪酸氧化，来防止肝脏脂肪变性和血脂异常，具有预防肥胖、辅助降血脂的作用[16-18]。橘皮素能通过诱导CYP1A1/CYP1B1介导的代谢途径，可抑制乳腺癌细胞的增殖[19]。随着陈皮黄酮研究的不断深入，许多生物活性研究尤其是动物实验受到单体数量的制约，因此亟需一种简便、高效的大量分离制备陈皮中橘皮素和川陈皮素的方法。

图1 橘皮素（a）和川陈皮素（b）的结构式Fig．1 Structural formulas of the tangeretin(a)and nobiletin(b)

本研究采用柱色谱法同时分离制备纯度较高的橘皮素和川陈皮素，采用柱层析硅胶为分离介质，不同比例的乙酸乙酯-石油醚混合液为洗脱溶剂，同时分离制备较高纯度的橘皮素和川陈皮素。该方法成本低，简单易行，可以同时大量制备橘皮素和川陈皮素，以期为陈皮生物活性的深入研究提供了重要的物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

陈皮：市售。

无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷（均为分析纯），甲醇、乙腈（均为色谱纯）：国药集团上海化学试剂有限公司。橘皮素和川陈皮素对照品：本实验室自制（经过1H-NMR、13C-NMR和ESI-MS鉴定结构，纯度采用HPLC峰面积归一化法计算均≥98%）。

1.2 仪器与设备

GWX-9623MB型电热鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；2XZ-1型旋片式真空泵：临海市谭氏真空设备有限公司；CCA-20型低温冷却水循环泵：巩义市予华仪器有限责任公司；RE-52AA型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；ZF7型三用紫外分析仪：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；BSA124S分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；1260型高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）：美国安捷伦公司；UltiMate 3000 plus型液相色谱-质谱（liquid chromatography-massspectrometry，HPLC-MS）联用仪：美国Thermo Fisher公司。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

HPLC 条件：Agilent C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）液相色谱柱；流动相：乙腈-水（梯度：0～15 min，40%～50%乙腈；15～20 min，50%～70%乙腈；20～25 min，70%～85%乙腈；25～30 min，85%～40%乙腈）；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；检测波长：326 nm；进样量：10μL。

质谱条件：电子电离（electrospray ionization，EI）源；检测方式为正离子模式，鞘气流速34.5 kPa；喷雾电压75 kV；毛细管温度320℃；辅助气加热器温度300℃。

1.3.2 对照品储备液的制备

分别精密称取5.0 mg川陈皮素和橘皮素对照品，用色谱甲醇超声辅助溶解并定容至10 mL容量瓶中，配制成0.5 mg/mL对照品储备液，保存于4℃冰箱中，备用。

1.3.3 橘皮素和川陈皮素样品的提取分离及检测

乙醇浸提：称取干陈皮粉，用无水乙醇于室温条件下浸提48 h，料液比1∶10（g∶mL），过滤并收集滤液，将滤液置于旋转蒸发仪减压蒸馏得陈皮粗提物Ⅰ。

有机溶剂萃取：将陈皮粗提物Ⅰ用适量蒸馏水配成混合悬浮液，混匀后加入一定体积的正己烷萃取2～3次，再用二氯甲烷萃取2～3次，合并二氯甲烷层，减压浓缩除去二氯甲烷溶剂即得陈皮粗提物Ⅱ。

装柱：称取200～300目的硅胶70 g置于烧杯中，加入100 mL石油醚（即加入干硅胶体积1倍的溶剂），用玻璃棒充分搅拌，搅成匀浆。将4 cm×30 cm层析柱管清洗干净并保持干燥，垂直固定在铁架台上，取一小团脱脂棉用溶剂润湿后塞入管底。将硅胶均匀的装入层析柱中，保持上部水平。然后在硅胶柱顶部加入适量海砂，用胶棒轻轻敲打海沙表面至水平。

洗脱：将适量陈皮黄酮混合物溶于少量二氯甲烷得悬浊液。湿法上样后，依次用不同比例的乙酸乙酯-石油醚溶液进行洗脱，乙酸乙酯的体积分数分别为20%、30%、40%、50%、60%，每40 mL收集一瓶，从第一瓶按照顺序编号，直到60%洗脱剂洗脱完毕。

检测：分别将不同编号样品收集瓶中的溶剂旋转蒸发至干，得到的固体物质用色谱甲醇溶解，过0.22μm滤膜后，直接注入进样瓶以供HPLC分析。

2 结果与分析

2.1 橘皮素和川陈皮素标准曲线

将对照品储备液采用逐步稀释法稀释至2.5μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL，得不同质量浓度的系列标准工作溶液，按1.3.1中色谱条件测定，记录峰面积。以每个标准工作溶液对应的峰面积（y）和其质量浓度（x）进行线性回归分析，得到川陈皮素标准曲线回归方程：y=31.719x+89.264（R2=0.999 9）；橘皮素标准曲线回归方程：y=37.632x+10.145（R2=0.999 8）。结果显示，川陈皮素和橘皮素在2.5～500μg/mL范围内线性关系良好。

2.2 陈皮粗提物Ⅱ中川陈皮素、橘皮素含量的检测

准确称取5 mg陈皮粗提物Ⅱ用色谱甲醇定容至10 mL，取1 mL溶液过0.22μm滤膜后经HPLC分离，检测得到化合物的峰面积，代入标准曲线回归方程计算，得陈皮黄酮混合物中川陈皮素含量为1.6 mg，橘皮素含量为1.1 mg。

2.3 陈皮粗提物Ⅰ与陈皮粗提物Ⅱ成分比较

川陈皮素和橘皮素标准品及二氯甲烷萃取陈皮粗提物前后经HPLC检测比较其中物质变化，结果如图2所示。

由图2A可知，标准品川陈皮素和橘皮素的保留时间分别为13.1 min、19.3 min。对比图2B和图2C可知，二者均含有较多川陈皮素和橘皮素，可见这两种多甲氧基黄酮是陈皮中的主要黄酮。陈皮粗提物Ⅰ经有机溶剂萃取后，多甲氧基黄酮纯度明显提高。这是因为正己烷萃取除去了稠膏中的非极性物质，且多甲氧基黄酮在二氯甲烷中溶解度很好，几乎所有的多甲氧基黄酮都溶于二氯甲烷层，而极性较强的杂质则大部分留在水溶液中。因此，陈皮粗提物Ⅰ通过正己烷和二氯甲烷萃取之后，混合组分得到了初步纯化，为后续的柱色谱分离得到陈皮多甲氧基黄酮单体奠定了基础。

图2 对照品（A）、陈皮粗提物Ⅰ（B）、陈皮粗提物Ⅱ（C）的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of reference substance(A),crude extractsⅠ(B)and crude extractsⅡ(C)from tangerine peel

2.4 正相柱色谱法分离陈皮黄酮混合物

按照1.3.3方法装柱，二氯甲烷萃取得到的陈皮粗提物Ⅱ上样后，依次用不同比例的乙酸乙酯-石油醚溶液进行洗脱，分别收集到25个样品瓶中，1～5#、6～10#、11～15#、16～20#、21～25#样品瓶分别是质量分数为 20%、30%、40%、50%、60%乙酸乙酯的洗脱剂洗脱所得溶液，同时用薄层色谱（thin layerchromatography，TLC）及HPLC跟踪监测。HPLC检测结果中，体积分数为30%乙酸乙酯洗脱后，流出物中开始出现川陈皮素和橘皮素，其中第8号样品瓶检测结果见图3。由图3可知，在保留时间21.9 min处有一个较大的物质峰，但在保留时间19.3 min处出现了一个较小的色谱峰，通过保留时间、紫外光谱及标准加入法确证了保留时间为19.3 min的物质为橘皮素。结果说明，体积分数为30%的乙酸乙酯极性较弱，根据相似相溶原理，可将陈皮黄酮混合物中极性较弱的物质洗脱下来，但在此极性条件下，橘皮素已经开始被淋洗下来，但含量很低，因而可以加大淋洗液极性继续进行洗脱。

图3 30%乙酸乙酯-70%石油醚洗脱剂洗脱样品8#的色谱图Fig.3 Chromatogram of the eluant of sample 8#eluted by 30%ethyl acetate and 70%petroleum ether

用体积分数40%的乙酸乙酯洗脱剂洗脱，主要得到一种物质，其中第12号管的液相色谱分离图如图4（a），通过面积归一化法进行计算，其纯度达到98.1%。与橘皮素的标准品比对发现，其保留时间和紫外吸收一致。取该样品同时进行MS检测，结果见图4（b），其分子离子峰为372.7，和文献报道一致[20]，进一步证实分离得到的物质为橘皮素。

图4 12#样品的色谱图（a）及质谱图（b）Fig.4 Chromatogram(a)and mass spectrum(b)of sample 12#

用50%乙酸乙酯洗脱之后主要得到4种物质，其中第16、18#管的色谱分离结果见图5。由图5可知，增大洗脱剂浓度，洗脱液中还残留橘皮素，但明显看到极性较大的物质开始被洗脱，保留时间为13.1 min时出现了目标色谱峰，根据保留时间和紫外光谱定性初步确定其为川陈皮素。18号管中橘皮素色谱峰继续减小，川陈皮素色谱峰明显增加。表明在此洗脱剂条件下，川陈皮素逐渐被洗脱，要想洗脱得到纯度较高的川陈皮素，则需要继续增大洗脱剂浓度。

用体积分数60%的乙酸乙酯洗脱剂洗脱，取第21号样品进行检测，结果如图6所示。由图6（a）可知，图6（a）中只出现了一个明显的色谱峰，通过保留时间和紫外光谱定性，初步确定该物质为川陈皮素。通过峰面积归一化法进行计算，其纯度达98.6%。取该样品同时进行MS检测，结果见图6（b），其分子离子峰为402.4，和文献报道一致[20]，进一步证实分离得到的物质为川陈皮素。

图5 50%乙酸乙酯-50%石油醚洗脱剂洗脱样品16#（a）和18#（b）的色谱图Fig.5 Chromatogram of the eluant of sample 16#(a)and 18#(b)eluted by 50%ethyl acetate and 50%petroleum ether

图6 21#样品的色谱图（a）及质谱图（b）Fig.6 Chromatogram(a)and mass spectrum(b)of sample 21#

3 结论

采用醇提结合硅胶柱色谱分离方法，以乙酸乙酯-石油醚溶液为洗脱剂进行洗脱，可以从陈皮中同时分离制备得到高纯度的橘皮素和川陈皮素单品，经HPLC进行纯度分析，并经质谱联用对其结构进行了确证。该方法的确立，为陈皮黄酮的生物活性筛选和体内实验的深入研究奠定了物质基础。