液相色谱法和液质联用法检测玉米中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的比较

姚 霞，聂 立，兰瑞容，彭章明，崔小亮

（1.宜宾市食品药品检验检测中心，四川 宜宾 644000；2.宜宾五粮液有机农业发展有限公司，四川 宜宾 644000）

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），又称呕吐毒素，是最常见的一种污染粮食、饲料和食品的霉菌毒素之一[1]，属于单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）、雪腐镰刀菌（Fusarium nivale）等真菌产生的次级有毒代谢物[2-34]。DON可以干扰核糖体肽基转移酶的活性，阻碍体内的核糖体正常循环，并且抑制蛋白质的合成，大量摄入会引起急性中毒，主要表现有头疼、头晕及呕吐，中枢神经系统紊乱等[5-6]。DON稳定性强，具有较强的耐热性和耐酸性[7]，在中性或酸性环境中，100℃、2 h只能小部分被破坏，有研究表明，DON使家兔的心、肝、肾和脾的组织细胞出现肿胀、空泡变性、炎性细胞浸润及细胞坏死的病理变化[8]，可促进免疫细胞凋亡并抑制免疫细胞增长，严重影响人和牲畜的健康。检测被其污染粮食作物（小麦、大麦、玉米等）刻不容缓，以避免人蓄误食，引起不必要的损害。

国标GB 5009.111—2016《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》中规定了DON的四个检测方法，分别是同位素稀释液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-massspectrometry，LC-MS）、免疫亲和层析净化高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法、薄层色谱测定法、酶联免疫吸附筛查法。前人做过很多工作，研究出很多DON的检测方法，比较常见成熟检测方法有高效液相色谱法[9-10]、气相色谱法[11-12]、液相色谱质谱联用法[13-15]、胶体金试纸条法[16]、薄层色谱法和酶联免疫吸附筛查法[17]等。胶体金试纸条法、薄层色谱和酶联免疫法成本较低，对检测人员要求不高，前处理方法较简单，一般用于定性和半定量检测。高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法，前处理相较麻烦，灵敏度高，能够准确的定性和定量检测。本研究分别比较免疫亲和柱-高效液相色谱法、免疫亲和柱-液质联用外标法和免疫亲和柱-液质联用内标法对脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行检测分析，旨在选择更准确高效、经济适用、环保的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米：市售；乙腈、甲醇（均为色谱纯）：美国Fisher Chemical公司；氨水、聚乙二醇（均为分析纯）：成都科龙化工试剂公司；IAC-SEP免疫亲和柱（1.2μg/2 mL）：北京中检维康生物技术有限公司；13C15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（25μg/mL，1 mL/支）：美国SIGMA-ALDRICH公司；脱氧雪腐镰刀菌烯醇（1 mg/支）：新加坡PRIBOLAB公司。

1.2 仪器与设备

SCIEX QTrap 4500液质联用仪：美国AB公司；e2695/2298液相色谱仪：美国Waters公司；ULUP-II-107超纯水机：西安优普仪器设备有限公司；HSC-24A氮吹仪：天津市恒奥科技发展有限公司；LD5-2A离心机：北京京立离心机有限公司；SB25-12超声波仪：宁波新芝生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色谱条件

Waters Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm），进样体积：20 μL，流速：1 mL/min，停止时间：15 min，流动相：水∶乙腈=90∶10（V/V），等度洗脱，柱温35 ℃，紫外检测波长218 nm。

1.3.2 液相色谱串联质谱条件

Waters Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm），进样体积：5 μL，流速：0.8 mL/min，停止时间：10 min，流动相：0.01%氨水溶液+乙腈，梯度洗脱，洗脱程序为98%氨水溶液+2%乙腈，维持0.8 min，98%氨水溶液+2%乙腈，维持0.8 min，76%氨水溶液+24%乙腈，维持3.2 min，100%乙腈，维持1 min，98%氨水溶液+2%乙腈，维持5 min。

质谱条件：多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM），喷雾电压4 500 V，离子源温度600℃，喷雾器Gas 1∶60，辅助气Gas 2∶70，碰撞气：中气压模式medium，MRM参数见表1。

表1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇分析的MRM参数Table 1 MRM parameters of deoxynivalenol analysis

1.3.3 标准溶液制备

加乙腈1 mL于脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品装样瓶，振荡，使溶解，转移至10 mL容量瓶中，多次用乙腈洗涤标准品装样瓶，洗涤液均转移至容量瓶中，最后用乙腈定容至10 mL，摇匀，得到质量浓度为100μg/mL标准储备液。取1 mL标准储备液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，得到质量浓度为10μg/mL标准工作液。

精密量取13C15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇内标1 mL于25 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至25 mL摇匀，配成内标溶液，质量浓度为1 000 ng/mL。

HPLC法标准曲线配制：准确移取10μg/mL标准工作液10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、500μL于进样瓶中，用乙腈+水（10∶90，V/V）定容至1 mL，得到质量浓度分别为100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL、5 000 ng/mL的系列标准溶液。LC-MS法标准曲线配制：将10μg/mL标准工作液用乙腈稀释10倍，得到质量浓度为1 000 ng/mL标准工作液，准确移取上述标准工作液10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、500μL于进样瓶中，再分别加入100μL内标溶液（外标法不加入内标），用0.01%氨水+乙腈（98∶2，V/V）定容至1 mL，得到质量浓度为10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL的系列标准溶液，内标质量浓度为100 ng/mL。

1.3.4 样品制备

HPLC法前处理：称取打碎的谷物制品25 g（精确到0.1 g）于具塞三角瓶中，加入5 g聚乙二醇（分散剂），加入纯水100 mL，振荡混匀，置于超声波仪中超声30 min，4 000 r/min离心5 min，收集上清液待净化；先将冷藏的免疫亲和柱恢复至室温，待免疫亲和柱内原有液体流尽后，准确移取上清液2 mL至免疫亲和柱中，控制流速1滴/秒，直至空气进入免疫亲和柱中，再分别用5 mL磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）和5 mL水先后淋洗免疫亲和柱，控制流速每秒1～2滴，弃去全部流出液，抽干小柱。准确加入2 mL甲醇洗脱免疫亲和柱，控制流速每秒1滴，收集全部流出液，再于45℃水浴氮吹近干，准确加入1 mL初始流动相，涡旋30 s溶解残渣，过0.45μm滤膜，收集滤液于进样瓶中供液相色谱测定。

LC-MS法前处理：称取打碎的谷物制品约2 g（精确到0.01 g）于50mL离心管中，内标法加入400μL内标溶液，外标法不加，振荡混合后静置30 min，加入20 mL乙腈-水（84∶16，V/V）溶液置于超声波仪中超声30 min，4 000 r/min离心5 min，收集上清液待净化；准确移取上清液5 mL于45℃水浴氮吹干，加入2 mL水充分溶解残渣，事先将冷藏的免疫亲和柱恢复至室温，待免疫亲和柱内原有液体流尽后，将上述溶液转移至免疫亲和柱中，后续步骤同液相法的净化过程，不同的是过0.22μm滤膜，收集滤液于进样瓶中供液相色谱串联质谱测定。

1.3.5 方法学验证

精密度试验：按照样品测定方法，HPLC法吸取质量浓度为1 000 ng/mL标准溶液，LC-MS法吸取质量浓度为100 ng/mL标准溶液，分别连续测定6次，比较测定结果的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），考察两种方法的精密度。

加标回收试验：取空白玉米样品，分别做3个水平加标回收试验，每个水平做3个平行，分别根据上述前处理方法处理，色谱方法上机检测，考察检测方法的准确度。

重复性试验：分别取3个不同的玉米样品，各做两个平行试验，前处理按照上述方法进行，免疫亲和柱净化，分别上高效液相色谱和液质联用仪分析，考察检测方法的重复性。

2 结果与分析

2.1 线性关系对比

在HPLC条件下，取上述不同质量浓度标准溶液供HPLC分析，以出峰时间定性，峰面积定量，标准曲线及液相色谱图结果分别见图1和图2。由图1可知，脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准曲线回归方程为y=74 700x-1 770，相关系数R=0.999 9，表明二者线性关系良好。由图2可知，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的保留时间为8.279 min。

图1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇液相色谱法标准曲线Fig.1 Standard curve of deoxynivalenol by HPLC

试验过程中发现标准溶液质量浓度5 000 ng/mL的点峰型趴，不尖锐，不对称，当把标准工作液的配制溶液由乙腈换成乙腈+水（10∶90，V/V）之后，再配制标准曲线的最大浓度点，峰型既对称又尖锐，分析原因是受溶剂效应影响，标准工作溶液是纯乙腈配制，标准曲线是用流动相配的，而最大的浓度点添加了500μL的标准工作溶液，水的极性大于乙腈极性，导致最大浓度点的溶液极性强度小于流动相极性强度，峰型变趴，换了标准工作溶液的配制溶剂后，再配制标准曲线的点，峰型既对称又尖锐。

图2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇液相色谱图Fig.2 Liquid chromatogram of deoxynivalenol

在LC-MS条件下，取上述不同质量浓度标准溶液供LC-MS分析，标准曲线及离子色谱图结果分别见图3和图4。内标法以出峰时间和定性离子与定量离子的离子比定性，内标准确定量；外标法以出峰时间和定性离子定性，定量离子峰面积定量。由图3可知，内标法标准曲线回归方程为y=0.008 39x+0.011 06，外标法标准曲线回归方程为y=7 333.5x+3 752.4，相关系数R2均为0.999 9，表明二者线性关系良好。由图4可知，LC-MS条件下，外标法和内标法脱氧雪腐镰刀菌烯醇的保留时间均为5.34 min。试验过程中没有发现峰型趴而不尖锐，可能是因为液质条件下进样体积减小，受溶剂效应影响小。

图3 脱氧雪腐镰刀菌烯醇液质联用内标法（A）及外标法（B）分析标准曲线Fig.3 Standard curve of deoxynivalenol analysis by LC-MS with internal(A)and external(B)standard method

图4 脱氧雪腐镰刀菌烯醇液质联用分析离子色谱图Fig.4 Ion chromatogram of deoxynivalenol analysis by LC-MS

结果表明，无论是高效液相色谱法还是液质联用法，线性关系都非常好，LC-MS出峰时间比HPLC法快。HPLC法受溶剂效应影响大，避免溶剂效应要用流动相配制标准品和样品。

2.2 精密度试验

表2 精密度试验结果Table 2 Results of precision tests

按照样品测定方法，HPLC法吸取质量浓度为1000 ng/mL标准溶液，LC-MS法吸取质量浓度为100 ng/mL标准溶液，分别连续上机测定6次，得到两种方法精密度试验结果如表2所示。由表2可知，HPLC法相对标准偏差最大，为1.31%，LC-MS外标法其次，为1.20%，LC-MS内标法最小，为0.37%，即LC-MS内标法精密度最高。但两种方法精密度均能满足试验需求。

2.3 回收率试验

取空白玉米样品，分别做低、中、高3个水平加标回收试验，每个水平做3个平行。LC-MS内标法同时还加入内标，LC-MS法的加标量分别是40μg/kg、200μg/kg、1 000μg/kg，HPLC法的加标量分别是200μg/kg、1 000μg/kg、2 000μg/kg。按照上述试验方法处理上机，得到加标回收率试验结果见表3。由表3可知，LC-MS内标法的回收率在113.48%～119.27%，LC-MS外标法回收率在105.56%～108.71%，HPLC法的回收率在80.77%～91.92%，其结果相对标准偏差（RSD）均＜5%。结果表明，3种方法均具有良好的准确度，均能满足检测要求。

表3 加标回收率试验结果Table 3 Results of adding standard recovery rate tests

2.4 重复性试验

按照样品测定方法，分别测定样品1、2、3中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量，考察方法的重复性，结果见表4。

表4 重复性试验结果Table 4 Results of repeatability tests

由表4可知，样品1没有被脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染，样品2和样品3轻度污染，GB 2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》为1 000μg/kg，3个玉米样品均符合国家标准要求。每个样品两次测定结果非常接近，重复性试验结果RSD均＜5%，表明重复性良好。

2.5 方法定量限和检出限

按照S/N=10和S/N=3分别计算两种方法的定量限和检出限，得到HPLC法的定量限和检出限分别为76.82μg/kg、23.05 μg/kg，低于国标[17]给定的定量限200 μg/kg、检出限100μg/kg。LC-MS法的定量限和检出限分别为1.67μg/kg、0.502 μg/kg，低于国标[17]给定的定量限20 μg/kg、检出限10μg/kg。结果表明，LC-MS法比HPLC法灵敏度高，两种方法均能满足国家标准要求。

2.6 样品实际检测

分别取3个不同的玉米样品，各做两个平行试验，前处理按照上述方法进行，免疫亲和柱净化[18-21]，分别上高效液相色谱和液质联用仪分析，检测结果见表5。由表5可知，HPLC法检测发现只有1个阳性样品，而LC-MS内标法和外标法检测发现3个样品均为阳性样品。对比两个试验结果发现，样品1和样品2，用HPLC法检测是阴性，而LC-MS法检测是阳性，含量均＜100μg/kg。

表5 不同玉米样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的检测结果Table 5 Determination results of deoxynivalenol content in different corn samples

为分析原因，做了空柱回收试验，即按试验流程，不加任何样品，只用试剂，上机检测发现高效液相色谱未检测到任何峰图，而液质联用仪检测出脱氧雪腐镰刀菌烯醇，质量浓度为19.384 ng/mL，说明这批免疫亲和柱有本底，而液质联用方法灵敏度比液相法高，检出限更低，造成样品1为假阳性，样品2被脱氧雪腐镰刀菌烯醇轻度污染，因为液相色谱灵敏度低，在其检出限以下，未能检测出来。样品3两种仪器均检测出脱氧雪腐镰刀菌烯醇，液相色谱检测出来比液质联用法低一些，是由于液质联用仪灵敏度高，免疫亲和柱有本底，液质联用外标法检测的结果中有本底，液质联用内标法经内标校正后造成结果偏高。

3 结论

比较免疫亲和柱-高效液相色谱（HPLC）法和免疫亲和柱-液质联用（LC-MS）法检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇。结果表明，两种方法的线性关系均良好，R2=0.999 9；HPLC法、LC-MS外标法及内标法精密度试验结果相对标准偏差（RSD）分别为1.31%、1.20%及0.37%，回收率分别在80.77%～91.92%、108.71%～105.56%及113.48%～119.27%，精密度，回收率及重复性试验结果RSD均＜5%；HPLC法的定量限和检出限分别为76.82 μg/kg、23.05 μg/kg，LC-MS法的定量限和检出限分别为1.67μg/kg、0.502μg/kg，均低于国标给定标准。

比较两种仪器的检测方法，LC-MS内标法，需要脱氧雪腐镰刀菌烯醇内标，我国尚未研制脱氧雪腐镰刀菌烯醇生物标准物质[22]，这些标准物质一般都是进口，价格昂贵，一支13C15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇内标几千块，只能做50批样品左右，试验成本大大提高。LC-MS法使用乙腈浸提，HPLC法使用水浸提，乙腈价格较高，有机物对实验人员也有一定伤害。在食品检测过程中，两种方法均能满足检测要求，综合考虑HPLC法更经济环保。在食品的脱氧镰刀菌烯醇的检测试验中，HPLC法线性和加标回收均能满足检测需要，实验室大批量检测时，HPLC法是较理想的选择。