蓝莓果渣中花色苷的超临界二氧化碳萃取工艺优化

秦公伟，韩豪，丁小维，，王艳龙

(1.陕西理工大学 陕西省资源生物重点实验室，陕西 汉中 723001；2.陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001；3.陕南秦巴山区生物资源综合开发协同创新中心，陕西 汉中 723000；4.汉中市农业科学研究所，陕西 汉中 723000)

蓝莓是杜鹃花科越橘属多年生灌木型果树，果实中含有大量的花色苷、维生素等活性成分，享有国际粮农组织赋予的“五大健康食品”之一美誉[1]。蓝莓中花色苷含量丰富，是公认的花色苷的提取源[2-3]。花色苷具有多种生物活性，已被应用在医药、日化、保健食品等多个领域，对糖尿病、视网膜病变、纤维性囊肿、视觉障碍等都有很好的疗效[4-5]。花色苷应用价值非常高，果实加工中其利用率却很低，最多达到3.3%，分析原因主要是传统的提取技术耗时长，且提取不完全，还可能是提取过程中由于高温或者其他因素破坏花色苷结构，导致提取率偏低[6]。

本文以蓝莓果渣作为花色苷的提取原料，研究绿色无残留的超临界二氧化碳萃取技术参数，旨在为花色苷的高效利用提供技术支持。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

蓝莓果渣(40 ℃恒温干燥后粉碎，过60目筛，通风干燥处保存备用)，陕西定军山蓝莓科技有限公司提供；乙醇、磷酸氢二钠、柠檬酸均为分析纯；二氧化碳(99.9%)。

FW117中草药粉末碎机；AL104电子分析天平；ST-1电热鼓风烘箱；SCF-CO2萃取实验装置；UV-260紫外可见分光光度计。

1.2 蓝莓果渣中花色苷的萃取

精确称取蓝莓果渣粉末50.00 g，装至超临界CO2萃取装置釜中，于40 ℃萃取压力30 MPa和CO2流率4.0 L/min萃取1.5 h。萃取完成后，降压，分离花色苷，称量计算得率。每次实验均进行三次平行验证，取平均值CO2循环使用。

2 结果与讨论

2.1 萃取温度的影响

按照1.2节的方法，探究萃取温度对蓝莓果渣中花色苷得率的影响，结果见图1。

图1 萃取温度-花色苷得率关系图Fig.1 Diagram of extraction temperature-anthocyanins yield

由图1可知，萃取温度升高，花色苷得率增大，40 ℃时达最大。升温加快了花色苷分子的热运动，有利于花色苷在超临界二氧化碳流体中的扩散。当萃取温度>40 ℃时，花色苷得率有减小趋势，花色苷属于热敏性物质，过高的温度会破坏其稳定性，反而不利于萃取。选择40 ℃为较佳的萃取温度。

2.2 萃取时间的影响

按照1.2节的方法，探究萃取时间对蓝莓果渣中花色苷得率的影响，结果见图2。

由图2可知，蓝莓果渣中花色苷的得率随萃取时间的增大先增大后减小，刚开始提取蓝莓果渣中花色苷时，由于提取剂(超临界CO2)和花色苷浓度差较大，推动蓝莓果渣中的花色苷向提取剂中扩散，花色苷得率增大，萃取时间2.0 h时，花色苷得率最大，说明此时基本达到萃取饱和状态，继续增大萃取时间，花色苷得率反而降低，这可能是因为花色苷长时间处于超临界状态下，有小部分已经发生降解。优选2.0 h为较佳的萃取时间。

图2 萃取时间-花色苷得率关系图Fig.2 Diagram of extraction time-anthocyanins yield

2.3 萃取压力的影响

按照1.2节的方法，萃取时间2.0 h，探究萃取压力对蓝莓果渣中花色苷得率的影响，结果见图3。

图3 萃取压力-花色苷得率关系图Fig.3 Diagram of extraction press-anthocyanins yield

由图3可知，萃取压力升高花色苷得率提高。萃取压力由30 MPa增大至35 MPa，花色苷得率变化很小，>35 MPa后，得率不增反减，可能是因为此时CO2的粘度过大，对传质和提取产生了一定的副作用；再者，压力过大也对萃取装置提出了更高的要求。选择30 MPa的萃取压力较合适。

2.4 CO2流率的影响

按照1.2节的方法，萃取时间2 h，探究CO2流率对蓝莓果渣中花色苷得率的影响，结果见图4。

图4 CO2流率-花色苷得率关系图Fig.4 Diagram of CO2 flow rate-anthocyanins yield

由图4可知，CO2流率增加，蓝莓果渣中花色苷得率增大，CO2流率≥4.0 L/min后，花色苷得率增大幅度非常小，给萃取后CO2的分离回收利用带来了更大的负荷，故选择4.5 L/min的CO2流率最合适。

2.5 响应面实验结果

在单因素实验基础上，通过Box-Benhnken中心组合实验对萃取温度、萃取时间、萃取压力和CO2流率4个因素进行优化，因素与水平设计见表1，结果见表2，方差分析见表3。

响应面实验中共有27组实验，其中 1～24为析因实验，25～27为零点实验，用来检测模型的误差。

表1 Box-Benhnken中心组合实验设计表Table 1 Box-Benhnken center combinationexperiment design

表2 响应面实验结果Table 2 Results of response surface method

表3 方差分析结果Table 3 Results of analysis of variance of experiment result

注：P<0.01表示极显著，标为**，P<0.05表示显著，标为*。

由表3可知，萃取时间(B)的影响极显著，萃取压力(C)的影响显著。各因素对蓝莓果渣中花色苷的提取的影响顺序为：萃取时间>萃取压力>CO2流率>萃取温度。交互项中，萃取时间(B)和萃取压力(C)、萃取压力(C)和 CO2流率(D)两组各自的交互作用对提取的影响均极显著。

模型R2=95.57%，说明仅有4.43%不能被模型很好的预测和分析，模型的失拟项P值为0.055 4 (Pr<0.05)，不显著，说明所建立的模型对设计涵盖的四个因素均能很好的预测和分析，无失拟因素存在，模型的可靠性好，故此模型可用于超临界二氧化碳萃取蓝莓果渣中花色苷的预测和分析。利用模型对表2的实验结果进行多元回归拟合，方程如下：

Y=1.467+0.012 667A+0.094 417B+0.040 25C+0.028 833D-0.210 375A2-0.047 25AB+0.005AC-0.026 25AD-0.153 75B2-0.086 5BC+0.033 5BD-0.1C2+0.081 75CD-0.269 125D2

从拟合方程可知，所有的一次项系数均为正，说明这四个因素均对蓝莓果渣中花色苷的提取存在正向作用，二次项系数均为负，因此四个因素存在一组固定值使得方程值最大。一次项前的系数越大，说明其对整个方程的结果影响越大，由方程式可知，萃取时间(B)所对应的系数值最大，萃取压力(C)所对应的系数次之，之后为CO2流率(D)和萃取温度(A)，这与方差分析中各因素对蓝莓果渣中花色苷得率影响顺序相吻合。

SAS软件包中的程序预测所得蓝莓果渣中花色苷的最高得率为1.482 194 mg/g，所对应的四个因素的最佳值为：A=-0.000 474，B=-0.285 212，C=-0.064 45，D=0.025 597，回代入表1，求得最佳工艺条件为：萃取温度39.997 63 ℃，萃取时间1.857 394 h，萃取压力34.677 75 MPa，CO2流率4.512 798 5 L/min。为了方便实际操作，取萃取温度40 ℃，萃取时间1.86 h，萃取压力34.7 MPa，CO2流率4.5 L/min，进行3次平行实验，验证模型预测结果的可靠性，三次平行实验的花色苷得率分别为1.480 4，1.483 9，1.486 6 mg/g，平均值1.483 6 mg/g。与模型预测的最大得率误差仅为0.095%，证实模型可靠，具有很好的预测效果，这对于大规模萃取蓝莓果渣花色苷具有很好的指导作用，超临界二氧化碳萃取技术绿色无污染，也利于花色苷后期的有效利用。

和文献[1]的响应面优化超临界CO2萃取蓝莓花色苷的得率(最优工艺参数：萃取时间60 min，萃取温度40 ℃，萃取压力28 MPa，液料比为 1∶7 g/mL，花色苷得率1.58 mg/g)比较，由于本实验采用的原料是蓝莓果渣，花色苷得率略低于未加工的蓝莓。蓝莓加工过程中，已经有部分花色苷被带走，因此蓝莓果渣中的花色苷的提取相对来说较困难，萃取时间和萃取压力均大于蓝莓鲜果中花色苷的提取。比较得率可知，蓝莓果渣中富含花色苷，将这部分资源更充分的提取和利用，可以大幅度提高蓝莓的经济价值。

2.6 花色苷紫外吸收光谱及色价测定

2.6.1 花色苷紫外吸收光谱的测定 精确称取最优条件下萃取的花色苷0.050 0 g，放入烘箱中，40 ℃恒温烘干至恒重。用体积分数60%的乙醇溶解，加入一定量的pH=3的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，用体积分数60%的乙醇溶液定容至100 mL，配制标准溶液，摇匀，静置1 h。精密量取1.00 mL放入100 mL容量瓶中，用体积分数60%的乙醇进行定容，静置1 h，用紫外分光光度计测定花色苷溶液在200～800 nm最大吸收波长，结果见图5[7]。

图5 花色苷紫外吸收光谱图Fig.5 Spectrum of anthocyanins UV absorption

由图5可知，花色苷有两处吸收峰，分别在280.4，530.8 nm处，530.8 nm处的吸收峰更显著，确定为最大吸收波长，色价测定也以此作为基准。

表4 花色苷溶液色价测定结果Table 4 Color characteristic of anthocyanins solution

由表4可知，体积分数60%乙醇溶解的花色苷色价最大，90%体积分数乙醇溶解的花色苷色价最小。色价越高，说明花色苷在此溶液中越易溶解。乙醇体积分数越大，极性与花色苷的极性相差越大，花色苷越难溶解。水、体积分数60%和70%的乙醇溶液均是花色苷良好的溶剂。乙醇本身对花色苷就有一定的纯化作用，可以去除花色苷中的各种杂质，蒸馏水和体积分数60%乙醇溶液溶解的花色苷的色价相差较小，说明超临界二氧化碳萃取得到的蓝莓果渣中的花色苷纯度较高，有益于后期的纯化精制应用。

3 结论

(1)超临界二氧化碳萃取不使用任何有机溶剂，不会对环境产生危害，保证了花色苷的天然性，保持了花色苷的活性和固有的功效，可应用于医药、食品、日化等领域，萃取完成后升温降压，分离得到的二氧化碳能循环使用，降低提取成本，是可持续应用的高效萃取技术。

(2)超临界二氧化碳萃取蓝莓果渣中花色苷的各因素的影响顺序为：萃取时间>萃取压力>CO2流率>萃取温度，优化所得的最佳工艺参数为：萃取温度40 ℃，萃取时间1.86 h，萃取压力34.7 MPa，CO2流率4.5 L/min。此条件下，蓝莓果渣中花色苷的得率达1.483 6 mg/g，与模型预测的最大得率误差仅为0.095%。