尿外泌体microRNA 与肾脏疾病相关性的研究进展

晏玥 王乙安 陈芳 谭千林 者星炜

昆明医科大学第一附属医院肾内科（昆明650500）

肾脏是非再生器官，肾脏疾病的确诊目前仍高度依赖肾穿刺活检。肾穿刺活检所引起的出血风险，其严重程度各不相同，从短暂性血尿或淋巴结血肿到危及生命的出血。基于以上原因，大多数情况下并未采取这一检查手段。尿液白蛋白、血尿素氮、血清肌酐水平等都是临床应用广泛的诊断指标，但仍需要更深入的检测结果才能掌握肾病的类型。鉴定肾脏病理类型的体液生物标志物对于非侵入性诊断方法的开发是必不可少的，也是未来疾病检测的发展方向。成熟的微小RNA（microRNA，miRNA）通过结合mRNA 作为转录后调节因子，主要功能是降解靶mRNA，参与增殖、死亡、代谢和分化等生理和病理过程［1］。文献报道发现，miR-192、miR-194、miR-204、miR-215和miR-216 在人肾脏中大量表达［2］。在随后的研究中，TIAN 等［3］研究发现miR-192 和miR-194 的表达水平在大鼠肾脏皮质中高于髓质，而miR-27b 在髓质中高表达。在人类和实验性啮齿动物模型中，使用微阵列和miRNA 测序的高通量筛选技术，可以观察到，在急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）和慢性肾病（chronic kidney disease，CKD）的进展期间肾脏中miRNA 的表达发生改变［4］。miRNA 作为一类调节因子在AKI 发病机制中的重要性首先在具有产生miRNA 所需的酶（Dicer）的肾近端小管特异性基因组缺失的转基因小鼠模型中得到证实［5］。因此，对于肾脏疾病的早期诊断和观察而言，评估miRNA 作为“疾病特异性核酸生物标志物”是至关重要的。

1 MicroRNA 的概述

1993年，AMBROS 等［6］在线虫中首次发现了第一个microRNA 命名为lin-4 的基因。它是一种不编码蛋白的小RNA。SHI 等［7］发现，lin-4 基因可以抑制核蛋白lin-14 基因的表达进而来调节线虫的发育。随着人们对miRNA 的深入研究，在不同物种中有越来越多的miRNA 的发现，这些发现不仅丰富了miRNA，也为miRNA 在各个领域的应用提供研究基础。

非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）从基因组的非编码区转录，被认为是“基因沙漠”，它们可以调节编码区上基因的表达。miRNA 是一种ncRNA，其成熟形式是18～25 个碱基长度的单链RNA 分子。miRNA 分子被RNA 聚合酶Ⅱ转录为具有茎-环结构的初级miRNA（primary mircoRNA，pri-miRNA），pri-miRNA 被Drosha 酶切割成70～100 个碱基的前体miRNA（miRNA precursor，pre-miRNA）。premiRNA 通过核输出蛋白5 转运到细胞质中，被另一种RNase III 酶——Dicer 酶切割成双链miRNA。再将双链miRNA 掺入到含有Argonaute 蛋白的RNA 诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）中，其中双链的一条链被降解。而另一条链则可自由结合靶mRNA 的3′非翻译区。最终，miRNA 在转录后水平调节其靶mRNA 的表达［8］。miRNA 调控着大量的基因，并在细胞增殖、凋亡和分化等几个关键的生物学过程中发挥重要作用［9］。

2 尿miRNA 与肾脏疾病

大多数miRNA 在细胞内被发现，以非常稳定的形式存在于血浆和血清中［10］。随着研究的不断深入，人们发现miRNA 也存在于其他体液中。WEBER 等［11］从健康人脑脊液、泪液、胸膜液、气管冲洗液、乳汁、初乳、腹水、尿液、精液、羊水和血浆中提取到了miRNA，并发现唾液中miRNA 的种类数量最多，有458 种miRNA；尿液中数量最低，有204 种miRNA。以上研究还鉴定了体液中特异性出现的miRNA，如泪液中的miR-637和脑脊液中的miR-577。但该项研究并未鉴定出尿液特异性存在的miRNA。这种特异性的miRNA是否存在且与肾脏疾病是否相关需要进一步深入研究。

外泌体（exosome）是大小约40～100 nm 的膜囊泡，属于细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），作为膜和细胞溶质蛋白、脂质和RNA 细胞之间传递的载体，广泛存在于尿液和血浆在内的多种体液中，介导体内不同细胞类型之间的细胞间通讯，从而影响细胞的生理和病理状态［12］。除了具有细胞间通讯的关键作用之外，外泌体越来越多地被认为是疾病的生物标志物和预后因子。尿液是肾脏疾病生物标志物的理想来源。尿液中含有多种细胞外囊泡，其中外泌体起着重要作用。尿外泌体（urinary exosome）是由泌尿系统中各种细胞分泌并释放到尿液中的细胞外囊泡，其携带与细胞来源相关的蛋白质、脂类、DNA、mRNA 和miRNA 等，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程［13］。由于外泌体可以反映原始细胞的生理和病理状态，且磷脂双分子层使细胞组分更稳定，因此尿miRNA 被认为是稳定存在的［14］。近年来，分析各种肾脏疾病尿液中miRNA 的研究越来越多。目前对于miRNA 是否能成为肾脏疾病的良好生物标志物的研究尚不确切，但迄今为止在这项研究中获得的结果是有意义的。

3 尿miRNA 与急性肾损伤

急性肾损伤（AKI）是由缺血性和毒性损伤等致病性疾病引起的常见临床状态。AKI 以血清肌酐水平作为诊断标准，但血清肌酐水平是非特异性的，对AKI 的早期识别不敏感。因此，寻找新的早期、敏感且可靠的生物标志物是未来探索的方向。

RAMACHANDRAN 等［15］对6 例非药物诱导的AKI 患者尿miRNA 的分析中发现，AKI 患者的尿miR-21、miR-200c、miR-423 的水平均显著高于对照组，而miR-4640 水平显著低于对照组。该研究首次报道了AKI 患者尿miR-4640 水平降低；另一项研究［16］也得出类似的结果，经药物诱导的AKI 患者尿miR-21、miR-200c 和miR-423 水平出现明显升高趋势。上述miRNA 被认为是肾损伤的敏感指标，可以作为肾损伤诊断和预后判断的指标。

miR-21 作为研究最多的miRNA，血清和尿液中的miR-21 水平被认为是可以预测接受心脏手术患者发生严重AKI 进展程度的指标［17］。在对早期心脏手术后心脏外科相关肾损伤（cardiac surgery associated acute kidney injury，CSA-AKI）与miR-21 相关性的研究发现，AKI 组心脏手术后6 小时血清和尿miR-21 表达水平显著低于非AKI 组；虽然术后血清和尿miR-21 水平均可预测AKI 发展，但与血清miR-21 相比，尿miR-21 能更好的预测AKI 的发展［18］。

在对缺血再灌注诱导的啮齿动物模型和人AKI 术后72 h 内尿miRNA 的动态分析中发现，大鼠模型术后尿液中miR-30c-5p、miR-192-5p 和miR-378a-3p 的表达显著升高，与微阵列分析和早期肾损伤分子-1（kidney injury molecule 1，KIM-1）结果一致；在AKI 患者中，术后2 h 也检测到miR-30c-5p和miR-192-5p水平升高，与基于蛋白质的生物标志物相比，miR-30c-5p显示出更好的诊断价值［19］。LIN等［20］发现在小鼠和AKI患者尿液中miR-494水平升高，还发现在正常人尿液中尚未发现的miR-16-5p，并认为miR-16-5p是AKI的一种特异性无创生物标志物。除此之外，在庆大霉素诱导的AKI 的研究中发现，大鼠腹腔注射庆大霉素第4天开始尿液样本中有4 种miRNA（mmu-miR-138-5p，mmu-miR-1971，mmu-miR-218-1-3p和rno-miR-489）水平不断升高，而庆大霉素、血清肌酐和尿素氮等标准标志物均未有变化［21］，这4 种miRNA 可能作为AKI 早期诊断的生物标志物。上述结果表明部分miRNA具有诊断和预测AKI进展的潜力。

4 尿miRNA 与慢性肾脏病

慢性肾脏病（CKD）是一种非常普遍的公共卫生问题，其发病率在世界范围内逐年增加。全世界大约有5 亿人患有CKD，其主要特征是带来包括心血管疾病、肾功能衰竭和过早死亡的不良后果；其主要组织学改变为肾小球硬化和肾小管间质纤维化；其严重程度通过肾小球滤过率和白蛋白尿来评估和诊断［22］。

4.1 肾间质纤维化与尿miRNA miRNA 可以在体内和体外高血糖条件下诱导肾细胞发生纤维化，促进肾小球功能障碍相关的细胞外基质蛋白的积累［23］。

LV 等［24］对35 例肾纤维化患者尿外泌体miRNAs 的分析显示，尿miR-29c 水平随着纤维化程度的进展而降低。CHUN 等［25］观察到尿miR-29c 水平降低与肾纤维化有关外，还观察到miR-21 和波形蛋白mRNA 的含量也与肾纤维化的程度有关。不仅如此，miR-29c 的表达降低与肝、肺和心脏纤维化的发生也相关［26-28］，miR-29c 被认为是纤维化疾病的重要治疗靶点。YU 等［29］发现白血病抑制因子通过酪氨酸位点激活STAT3 磷酸化，上调miR-29c 而发挥抗肾纤维化的作用。此外，在狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）患者中也观察到尿miR-29c 水平下调［30］。HSU［31］和YU［32］两个研究小组通过分析不同程度肾纤维化的CKD 患者尿外泌体miRNAs 发现，miR-200 家族中的miR-200b 和miR-200c 在肾纤维化过程中水平均显著降低，其中miR-200b降低更明显。MURALIDHARAN 等［33］以28 例CKD 患者为研究对象，对肾小球滤过率降低的患者循环和尿液中的miRNA 进行分析发现，当估计肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）＜30 mL∕（min·1.73 m2）时患者尿中let-7a 明显下调，miR-130a 显著上调；eGFR 降低者尿和血浆中miR-1825 和miR-1281 显著上调，血浆miR-423 明显下调。结合既往研究结果，可以明确miRNA 与肾纤维化有关，特异性的尿液和血浆miRNA 谱可能在CKD 中具有诊断和判断预后的价值。

4.2 糖尿病肾病与尿miRNA 糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）继发于糖尿病，是导致肾功能衰竭最常见的疾病。DN 是由葡萄糖稳态受抑制引起的肾小球毛细血管和管状结构和功能改变引起的进行性肾病［34］。但最近的研究表明，糖尿病患者可能在非白蛋白尿状态下或在微量白蛋白尿开始前已有发展为DN 的趋势［35］。

通过采用实时聚合酶链反应（qPCR）分析糖尿病大鼠尿外泌体miRNA 的检测中观察到miRNA-451-5p 和miR-16表达增加，在3～6 周即可观察到miR-451-5p 显著增加［36］。PRABU 等［37］首次在对452 位亚洲印度人群Ⅱ型糖尿病患者的研究中发现，尿let-7i-3p，miR-24-3p 和miR-27b-3p 水平增加，miR-15b-5p 水平降低；且尿miRNA 与尿微量白蛋白尿的程度相关。最近的一项研究显示，与Ⅱ型糖尿病非白蛋白尿患者相比，亚洲Ⅱ型糖尿病微量白蛋白尿患者的尿外泌体miR-192，miR-194 和miR-215 的水平增加，并且这种增加与血液转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）水平相关［38］，以上miRNAs 不仅对DN 早期诊断有意义，也可能参与纤维化的进展。一项针对Ⅰ型糖尿病的研究中报道指出，Ⅰ型糖尿病患者中微量白蛋白尿组miR-377 表达水平升高，miR-216a 表达降低，尿miR-377 和糖化血红蛋白、尿白蛋白肌酐、颈动脉内膜厚度之间呈正相关，而尿miR-216a 与这些变量呈负相关［39］。另一项研究发现尿外泌体let-7c-5p 与肾小球滤过率、DN 进展有关，其可能是DN 潜在的生物标志物［35］。KHURANA 等［40］在CKD 患者和健康对照组之间筛选出30种在尿外泌体中差异表达的miRNA，认为let-7c-5p 可能是预测CKD 进展的生物标志物。

4.3 狼疮性肾炎与尿miRNA 狼疮性肾炎（LN）是系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）的主要并发症和致死因素之一，肾穿刺活检是LN 的主要诊断手段［41］。目前亟待寻找一种新的无创、简便的诊断方法。TANGTANATAKUL等［42］研究发现，活动性LN患者尿let-7a和miR-21 明显低于非活动期患者，在随访过程中还发现二者在疾病发作期均下调，并在整个疗程后表达升高。因此，认为let-7a和miR-21可以指导狼疮性肾炎的临床分期。

4.4 其他肾脏疾病与尿miRNA IgA 肾病是最常见导致终末期肾病的原发性肾小球肾炎［43］。一项临床队列研究分析了IgA 肾病患者尿外泌体miRNA 的差异，结果显示IgA 肾病患者的miR-25 较对照组显著增加［44］。另一项研究显示，IgA 肾病患者尿miR-215-5p 和miR-378i 显著上调，而miR-29c 和miR-205-5p 显著下调；此外，miR-215-5p、miR-378i、miR-365b-3p 和miR-135b-5p 的表达情况与高通量测序分析结果相一致［45］。DUAN 等［46］通过miRNA 芯片技术对9 例IgA 肾病患者的214 种miRNAs 表达水平进行了分析，发现尿沉渣中miR-144-3p 和miR-486-5p 呈高表达。ZHANG 等［47］报道，在对局灶节段性肾病的研究中发现，与肾脏疾病完全缓解组和正常对照组相比，活动性局灶节段性肾小球硬化组中尿miR-196a 显著升高，而三组血浆miR-196a 无差异，说明尿miR-196a 可能对局灶节段性肾小球硬化活动情况有判断意义。

5 小结与展望

自miRNA 被发现以来，人们对miRNA 的功能及其潜在价值的认识呈倍数增长，与此同时随着体液中miRNA的发现，尿外泌体miRNA 也成为包括急性肾损伤、糖尿病肾病在内的肾脏疾病早期诊断的研究热点。经过不断的努力，虽然目前国内外对尿外泌体miRNA 作为诊断肾脏疾病新的生物标志物进行了有益的探索，但仍处于初级阶段，仍有许多问题需要解决：（1）尿miRNA 与肾脏疾病的发生发展机制研究尚浅，未系统阐述。（2）研究缺乏疾病早期诊断和指导治疗的生物标志物，部分疾病无准确的临床分期标准。（3）肾脏疾病存在病因多样、发病机制复杂等特点，涉及到的尿外泌体miRNA 也依据病因或致病机制不同而有差异，无法用一种miRNA 来诊断或判断疾病的严重程度，缺乏疾病诊断的特异性。（4）尽管已发现部分尿miRNA 可作为疾病早期诊断的潜在标志物，但大多处于基础研究阶段，缺乏大样本和多中心的验证。（5）现今分离和富集尿外泌体的技术和方法较多，但存在程序复杂、设备昂贵等问题，难以在临床推广应用，使得尿miRNA 的应用也受到限制。为此，需要进一步系统研究尿外泌体miRNA与肾脏疾病的病理生理机制。