不同标本类型对肺结核病原体检测的临床价值

杜秋蓉，杜 笠，胡琼英，刘祥琴

(1.成都中医药大学附属医院检验科，四川 成都 610075；2.成都天府新区人民医院检验科，四川 成都 610213；3.四川省医学科学院·四川省人民医院检验科，四川 成都 610072)

结核分枝杆菌是引起结核的病原菌。据世界卫生组织统计，2017年有130万人死于结核病[1]，且每年多达1000万人继续患结核病，仍然是全球主要的健康威胁[2]。结核分枝杆菌主要检测的途径有抗酸染色涂片法，细菌快速培养法以及利用荧光PCR法。根据大量文献的研究结果显示，荧光PCR的检测方法对结核分枝杆菌的检出率较高，也是快速、特异、准确且经济的方法，优于抗酸染色涂片法和细菌快速培养法等各类方法[3～5]。本文收集了四川省人民医院及成都中医药大学附属医院2017年1月至2018年7月确诊为肺结核的132例患者的标本，进行结核分枝杆菌核酸检测，分析检测结果，从而探索标本类型(支气管灌洗液、痰液、血液)对肺结核检出情况。

1 资料与方法

1.1 一般资料2017年1月至2018年7月四川省人民医院及成都中医药大学附属医院门诊就诊的132例肺结核患者，均根据《中华人民共和国卫生行业标准肺结核诊断标准(WS288-2017》[6]确诊，同时采集痰液、支气管灌洗液及血标本送检，进行荧光PCR技术，分析检测结果。

1.2 仪器与试剂仪器：美国ABI 7500实时荧光PCR仪。试剂：达安基因股份有限公司结核杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光法)。

1.3 方法

1.3.1标本的采集 ①痰液的采集及处理：用无菌杯取受检者肺深部咳出痰液1～3 ml密闭送检。痰液中加入1倍体积的4%NaOH，37 ℃放置30分钟左右液化(每间隔10分钟摇匀一次)，取1.0 ml到1.5 ml离心管中，振荡摇匀，离心12000 rpm 5分钟。去上清，沉淀加无菌生理盐水1 ml混匀，再次12000rpm离心5分钟，重复洗涤两次，移去上清，沉淀备用。②支气管灌洗液的采集及处理：用无菌杯收集支气管灌洗液5～10 ml密闭送检，所取标本有黏液时同痰标本的处理；无黏液时，混匀后取1 ml离心12000 rpm 5分钟，移去上清，沉淀加无菌生理盐水1 ml混匀，再次12000rpm离心5分钟，洗涤一次，移去上清，沉淀备用。③血液的采集及处理：抽取静脉血1 ml(抗凝)，用生理盐水稀释1 ml，慢慢转移至含淋巴细胞分离液1 ml的无菌管中(切勿混匀)，离心2000 rpm 10分钟，吸取白细胞层于1.5 ml离心管，离心12000 rpm 5分钟，弃上清，沉淀加无菌生理盐水1 ml混匀，离心12000 rpm 5分钟，洗涤一次，移去上清，沉淀备用。

1.3.2核酸的制备 将上述备用的沉淀标本中分别加入50 μl TB-DNA提取液充分混匀，6000 rpm离心60秒，置于100 ℃金属浴10分钟裂解，待冷却后取出，12000rpm离心5分钟，上清液备用。

1.3.3质量控制 试剂盒的阴性对照及质控物与检测标本同样处理，提取核酸。

1.3.4PCR扩增 取单管单人份的TB-DNA的PCR反应管若干(N+2个，N代表样本数，2分别代表一个阳性质控，一个阴性质控)，分别加入处理后样品或者阴性质控品、阳性质控品5 μl，并6000rpm离心60秒。将上述各反应管放入ABI 7500型实时荧光PCR仪内进行扩增，反应条件：93 ℃→2分钟预变性，之后93 ℃ 45秒→55 ℃60秒，反应10个循环，93 ℃ 30秒→55 ℃45秒30个循环。

1.3.5结果分析 反应结束后，将检测结果的数据保存至电脑，然后对图像结果进行分析并调节baseline的start值(2～4)，stop值(7～9)及Threshold值，再到Reporter窗口观察并记录仪器自动分析得出的Ct值。质控：阴性质控为阴性(Ct值>临界阳性质控，同时Ct值≥30)，扩增曲线无增长，则本次实验有效；阳性质控为阳性(Ct值<临界阳性质控Ct值)，有明显扩增曲线，则本次实验有效。标本结果判断，在阴、阳性质控结果有效的情况下，阴性结果Ct值≥30，无扩增曲线，则结果判断为阴性。如Ct值<28，有明显扩增曲线，则结果判断为阳性。

1.4 统计学方法采用SPSS 22.0软件分析数据。计数资料比较采用卡方检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

132例患者三种不同标本中，支气管灌洗液检出结核分枝杆菌123例，未检出9例，阳性检出率93.2%；痰液检出结核分枝杆菌94例，未检出38例，阳性检出率71.2%；血液检出结核分枝杆菌5例，未检出127例，阳性检出率3.8%。检出率最高的标本为支气管灌洗液，其次为痰液，最低为血液标本。见表1。

表1 三种标本检出TB-DNA的阳性结果比较

①与痰液比较，χ2=21.8，P< 0.05；②与血液比较，χ2=211.2，P< 0.05；③与血液比较，χ2=128.0，P< 0.05

3 讨论

结核病的病原体是由分枝杆菌属的结核分枝杆菌复合菌群感染所致，该复合菌群含有引起人和动物感染发病的若干亚群，这些亚群感染人体组织后其临床表现类似，引起的组织学改变也相似，都能导致肉芽肿性炎变，伴或不伴干酪样坏死[7]。由于该类细菌抗酸染色都呈阳性，因此单纯依据抗酸染色结果和组织学改变来诊断结核病并不可靠。然而利用荧光PCR的方法进行TB-DNA的PCR反应，每复制1个特异核苷酸片段，就有1个探针被切断，并释放一个荧光信号。因为被释放的荧光基团数目和PCR产物是一对一的关系，所以用荧光检测技术检测出的荧光信号有无或强弱，则代表扩增产物有无或多少。荧光PCR技术对结核分枝杆菌的诊断具有快速、特异、敏感等特点，因此也成为结核病分子诊断的最有力的方法[8]。本文利用荧光PCR技术对临床常用三种标本(痰液、支气管灌洗液、血液)进行结核分枝杆菌检测，并对检测结果进行了分析，其目的就是为临床提供科学的、合理的采集标本。

对于血液标本来说，由于结核分枝杆菌的生长特点，一般不会是在血液中繁殖，只是通过血液等传播到相应的组织、器官等形成病灶，血液具有流动性，在血液中采集结核分枝杆菌具随机性，故而血液中的结核分枝杆菌不易采集到且其存在的量也很少。再次，只有在结核分枝杆菌感染早期或者通过血液再次继发感染其他组织或者器官时，血液标本才可能检测到结核分枝杆菌(临床认知不足，认为采血方便)，所以血液标本对结核分枝杆菌检出率很低。本研究结果也证实了这一点。在确诊肺结核患者的132例血液标本，检出阳性的只有5例，未检出的则占大部分。

对于痰液标本，现在的患者并不都能完全的深咳出合格痰液，且肺结核患者多为少痰或无痰，再次，临床结核的排菌特点——间歇排菌，导致临床上痰找抗酸杆菌阳性率低，易漏诊误诊[9]。所以从本试验确诊肺结核的痰液标本共132例，检出的有94例，检出率仅有71.2%，未检出的有38例。而支气管灌洗液检出率达93.2%，这与痰液标本检出率71.2%相比较，就可说明这132例患者痰液中未检测出阳性结果的不是患者本身没有结核分枝杆菌，而是采集到的标本可能没有结核分枝杆菌存在，检出率自然降低。故临床医生选择痰液标本，为避免漏检，应多次采样检测。

肺泡灌洗液是利用支气管镜向支气管及肺泡内注入生理盐水并吸出。收集肺泡表面的有效液体进行可溶物或者细胞的检查。对于支气管灌洗液，采集此类标本时，肺泡灌洗液进入远端气道和肺泡腔中，接触病灶范围较广，标本量较大，含菌量较多且借助外力采取，因此主观影响因素较少，最后标本充分离心沉淀，检出率可大大提高。同时，灌洗刺激患者咳嗽，更有利于局部支气管分泌物的引流，还可避免口咽部细菌对样本的污染[10]。并且，支气管肺泡灌洗术是一种安全的检测方法，即使对儿童，其安全性也能得到保证[11]。以上充分证实了，支气管灌洗液此类标本是检测肺结核中结核分枝杆菌的最佳标本类型。然而，在此次的调查结果中利用支气管灌洗液这类标本检测结核分枝杆菌，有9例患者未测得阳性结果，其原因有可能是标本采集不当，或未采集到结核分枝杆菌，也有可能是采集到的细菌数量较少，在利用荧光PCR法提取标本时，未提取到达检测范围的量，未能检测出。所以，针对结核分枝杆菌的检测都应多次采样检测，以防漏检。

总之，利用荧光PCR测定肺结核中的TB-DNA，检出率最高的标本类型是支气管灌洗液，支气管灌洗液的检出率远远高于痰液和血液的检出率。这与多年利用荧光PCR法测定结核分枝杆菌的实验结果发现相吻合，证实了血液对于结核分枝杆菌的检测确实检出率太低，检测价值不大这一结论。提示临床医生在选择利用PCR技术检查肺部及肺周结核分枝杆菌时可首选支气管灌洗液这类标本，并且不同时段多次采样，减少漏检率。因此，利用荧光PCR技术检测支气管灌洗液中的TB-DNA，这一方法和实验标本可以准确，简便，快速测定出结核分枝杆菌，其值得推广应用。