miR-1与惊恐障碍发病及疗效的关联性研究

闵文蛟，黄雨兰，汪瑾宇，邹志礼，杨程惠，周 波

(四川省医学科学院·四川省人民医院心身医学中心，四川 成都 610072)

惊恐障碍以反复心悸、气紧等发作，伴强烈濒死感或失控感为特征；患者常反复就医，社会功能受到严重影响。目前认为遗传因素对PD发病具有重要作用[1]。miRNA可参与调节大约30%的人类蛋白质翻译，成为脑发育异常、神经递质改变和不同治疗反应的统一链接[2]。miRNA-1广泛存在于甲状腺、心脏等器官中，与代谢性疾病、精神疾病等密切相关[3]。本研究探讨miR-1与惊恐障碍发病及药物疗效的关联性，为疾病预测及治疗转归提供可能的血清标志物。

1 资料与方法

1.1 一般资料2014年7月至2015年8月我院收治的67例惊恐障碍住院患者，纳入标准：①中国汉族惊恐障碍患者，年龄18～55岁，性别不限；②符合《美国精神障碍诊断与统计手册》第四版(DSM-IV) 惊恐障碍诊断标准，由统一培训的富有经验的精神科医师通过系统精神检查确诊(其一致性检验的Kappa值大于0.8)；③14项基线汉密尔顿焦虑量表(HAMA)量表评分>14分[1]；④入组前2周内未接受任何抗焦虑药物治疗(其中4周内未接受氟西汀治疗)；⑤未接受任何激素治疗；⑥女性患者未使用任何口服避孕药物；⑦签署知情同意书。排除标准：①既往患有或合并其它精神疾病，包括精神分裂症、双相情感障碍、抑郁症、精神活性物质滥用或依赖、强迫症、精神发育迟滞以及药物所致精神障碍等，以及存在轴Ⅱ类疾病，包括人格障碍等；②患有严重躯体疾病，包括内分泌、心血管疾病、神经系统疾病等，严重脑外伤史，体格检查或实验室检查发现明确异常者；③怀孕或哺乳期妇女。同期63例西南地区汉族健康人群(对照组)，年龄18～55岁，性别与病例组匹配，且具有相似的人文地理背景。并由统一培训的评估人员使用DSM-IV轴I定式临床精神检查(SCID-NP)，排除目前或既往患有精神疾病或严重躯体疾病者。

1.2 方法

1.2.1评估与治疗 收集所有研究对象的年龄、性别、文化程度、婚姻等基本人口学资料。病例组患者在入组时进行基线HAMA-14及惊恐障碍严重程度量表(PDSS)评估；入组后接受为期6周的舍曲林治疗(50～200 mg/d，根据病情调整剂量)，期间除失眠及发作时使用阿普唑仑或吸氧治疗外，不能使用其它药物及非药物治疗方案。治疗结束后，所有患者再次接受HAMA-14及PDSS量表评估。HAMA-14包含2个因子：躯体性焦虑(7～13条目)、精神性焦虑(1～6和14条目)。PDSS减分率超过40%被定为临床有效；HAMA-14得分小于7分且无惊恐发作及社会功能损害被定为临床治愈[1]。

1.2.2血样采集及遗传学实验 所有研究对象在入组时均采集5 ml外周静脉血，病例组在6周治疗完成后再次采集5 ml外周静脉血。所有采集的血样标本使用EDTA抗凝，4°C离心分层，保留上层清液(血浆)，并留取1 ml进行RNA提取。根据说明使用TRIZOL-LS试剂提取血浆RNA，并使用NanoDrop ND-1000进行RNA浓度和纯度检测。使用ViiA7 RT-PCR系统检测样本中miR-1表达水平，引物：F：5’ GGGGTGGAATGTAAAGAAGT3’，R：5’CAGTGCGTGTCGTGGAGT3’。8 μl反应液体系如下：1 μl cDNA、5 μl 2倍Master混合液、10 μM的正反引物各0.5 μl、1 μl纯净水。PCR反应条件如下：95°C预变性10分钟，之后95°C变性10秒、60°C退火60秒、95°C延伸15秒，此三步重复40个循环。使用hsa-miR-423-5p作为内参[4]，并使用2-ΔΔCt法进行相对表达水平计算。

1.3 统计学方法采用SPSS 18.0统计学软件处理数据。计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用卡方检验；相关性分析采用Pearson相关分析。检验水准α=0.05。

2 结果

纳入的研究对象中，7例患者及3例健康对照者血样标本不合格(血样标本量过少或溶血)而剔除。最终60例患者及60例对照者纳入统计分析。

2.1 两组基本人口学资料及miR-1表达水平比较

病例组男∶女=2∶3，年龄(35.13±10.09)岁，对照组男∶女=4∶11，年龄(32.13±7.62)岁，两组基本人口学资料比较，差异无统计学意义(P> 0.05)。病例组miR-1表达水平低于对照组(1.098±0.388vs4.117±2.643，t=-4.375，P<0.001)。

2.2 治疗前miR-1表达水平与临床特征及量表评分的相关性分析miR-1表达水平与发病年龄及病程均无相关(P> 0.05)。miR-1表达水平与HAMA13条目(自主神经症状)和PDSS3条目(预期性焦虑的严重程度)得分呈负相关(P<0.001)，见表1。

表1 治疗前miR-1表达水平与HAMA-14、PDSS量表评分的相关性

2.3 治疗前后miR-1表达水平比较治疗后miR-1表达水平较治疗前下降(1.098±0.388vs0.377±0.369，t=5.14，P< 0.001)。miR-1表达水平的变化与HAMA-14、PDSS量表各项评分变化之间不存在关联性(P> 0.05)，见表2。

3 讨论

虽然遗传因素被认为在惊恐障碍的发生发展中具有重要作用，连锁关联性分析亦发现数个致病相关基因多态性，如COMT的val158 met、TPH的rs4570625、5-HTTLPR等[5]。但其研究结果目前尚不一致，阳性重复率较低[6]。而miRNA被认为可能代表了一种新层次上的基因表达调控方式，其表达量的改变会影响脑内许多相关基因的表达，在精神障碍的基因组复合结构网络中起到重要调控作用[7]。同时，既往研究发现，抗精神病药物亦可改变体内特定miRNA的表达，并随病情改善而变化[8]。Kim等在韩国人群中发现miR-22、miR-491多态性变异与惊恐障碍遗传易感性相关[9]。但迄今为止，关于惊恐障碍的miRNA相关研究较少，结果可重复性不高，尚处于起步阶段。

表2 治疗前后miR-1表达水平变化与HAMA-14、PDSS量表评分变化的相关性

△治疗前后量表评分变化值；#治疗前后miR-1表达水平变化

miRNA-1是一种研究较为广泛的miRNA分子，在多种疾病发生及治疗中具有重要作用。研究发现，miR-1在肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌等多种肿瘤疾病中表达下调[10]，其上游启动子C/EBPα(含亮氨酸锌指结构域的转录因子家族成员) 常在上述疾病中失活。miR-1能调节多种致癌基因的表达，并在下游经典致癌基因信号通路中发挥关键作用[11]；它可以调节甲基化相关酶而改变肿瘤细胞DNA的甲基化状态，从而调节肿瘤的生长和转移。此外，miR-1通过抑制Hand2的蛋白表达，在心肌发育和抑制心肌肥厚过程中发挥重要功能，伴或不伴糖尿病的心肌肥大患者中miR-1表达均出现异常，表现为明显下调[12]。本研究首次发现miR-1在惊恐障碍患者血浆中表达明显下调；同时，我们发现miR-1表达水平与惊恐障碍患者自主神经症状和预期性焦虑密切相关，其表达水平越低，患者的焦虑水平及四肢发麻、心慌、胸闷等躯体症状越明显，能在一定程度上成为疾病发生及临床症状严重程度水平的预测分子。而miR-1在心肌、骨骼肌组织中特异性表达，与心肌疾病、肿瘤发生的密切相关；研究发现，miR-1表达下调可能诱发心律失常，这与miR-1参与调节内源性钙离子交换通路基因Stx6有关[13]；因此不排除惊恐障碍可能存在与心律失常、肿瘤等疾病相关或相似的靶基因调控通路，这为惊恐障碍的进一步病理生理机制研究提示了一定线索。

目前认为miR-1能够引发细胞凋亡，并由此成为化疗的潜在靶点[14]。本研究发现miR-1与惊恐障碍药物治疗效果相关联，经过6周舍曲林治疗后患者血浆表达水平明显降低，这虽然与前述的miR-1在病例组表达水平下调相矛盾，但仍然提示miR-1可能在抗焦虑药物作用机制中发挥重要作用，也为今后疾病治疗药物的研发提供了一定方向。但由于miR-1的表达亦受到表观遗传的修饰作用，例如肺癌细胞中核小体组蛋白超乙酰化可抑制其表达[15]，肝癌细胞中，miR-1-1的CGI甲基化亦会引起miR-1表达受抑制，而miR-1的缺失可引起肝癌相关组蛋白甲基转移酶G9 a的上调[16]。因此，我们设想本研究发现在治疗后miR-1水平反而下降的结果不排除可能在药物作用过程中可能同时激活了对miR-1产生抑制的表观遗传修饰，这亦需要今后进一步扩大样本以及进行靶基因层面的探讨以明确。

本研究存在的局限：由于条件有限，研究样本量相对偏少，可能对结果的统计效能产生一定影响，但本研究仍揭示了miR-1与惊恐障碍发病及转归存在关联性趋势，有助于今后大样本进一步探讨。本研究入组患者仅使用舍曲林治疗，未能评估其它抗焦虑药物疗效与miR-1表达水平变化之间的关联性，但单一药物治疗有助于避免不同药物效应的混杂因素，使得结果更为可靠。今后可进行不同药物治疗分组，探讨miRNA表达水平与不同药物疗效之间的相关性。

总之，本研究首次在中国汉族人群中揭示了miR-1与惊恐障碍发病以及疗效的关联性，同时发现该miRNA表达与患者的焦虑水平及自主神经症状密切相关，为进一步在分子遗传学方面探讨疾病发生及转归提供了一定线索，也有助于今后基于基因表达调控的个体化优化治疗方案的开展。