DPP-4基因多态性与大动脉粥样硬化型脑梗死患者预后的相关性分析

晏 昆，蒙 凌，陈玉芳

(广州新海医院神经内科，广东 广州 510300)

大动脉粥样硬化性脑梗死是一种重要的缺血性卒中类型，也是中国死亡和残疾的重要原因[1，2]。动脉粥样硬化是脑梗塞的主要病理基础[3]。炎症反应可能在动脉粥样硬化和脑血管疾病的病理机制中发挥重要作用[4]。编码二肽基肽酶4(Dipeptidyl peptidase，DPP-4)的DPP4基因，也称为细胞表面抗原CD26，位于染色体2q24.3上，其主要表达于内皮细胞，循环血小板，单核细胞，中性粒细胞和某些T细胞亚群的表面，DPP-4是一种II型跨膜蛋白，通过脱落过程被切割下来并作为可溶形式(sDPP-4)释放到循环中，具有作为结合和信号蛋白的非酶功能，在炎症和心血管调节中起作用[5～8]。DPP-4已被证明在炎症反应中起双重作用(促炎症或抗炎症)。它可以通过整合素的上调介导细胞粘附，在白细胞的跨内皮迁移，抑制T细胞介导的信号转导和调节血小板功能中起重要作用。另一方面，它可以发挥作用通过增加白细胞活化阈值，抑制促炎细胞因子的产生和维持血管屏障的完整性来实现抗炎作用[9～11]。DPP-4基因多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)与许多自身免疫性疾病和炎症性疾病有关[12]。研究表明，DPP-4基因多态性与巨细胞动脉炎、Behcet有一定程度的相关性[13]。本研究探讨DPP-4基因rs1558965、rs1558957位点SNP对大动脉粥样硬化型脑梗死患者预后的影响，为大动脉粥样硬化型脑梗死患者预后的治疗提供理论及临床依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料2015年1月至2017年6月我院神经内科住院治疗的大动脉粥样硬化型脑梗死患者110例，均经临床神经系统检查，经颅多普勒定义大血管病变，经超声检查(TCD)、颈动脉彩色超声检查和头部磁共振血管造影(MRA)、脑CT和/或MRI确诊。大动脉粥样硬化型脑梗死的诊断标准为中国第四次全国脑血管病大会的标准：①颅内外：除穿支动脉疾病区独立梗死灶外梗死，在颅内、颅外大动脉粥样硬化区易损板块狭窄面积≥50%；支动脉疾病区孤立梗死灶类型，影像学检查穿载体动脉粥样硬化斑块或不同程度的动脉粥样硬化狭窄；非心源性脑梗死；排除其他因素的病因。②主动脉弓：多发性脑梗死病灶，且受累最严重部位为双侧前循环及(或)双侧后循环部分存在前后一起发；未检测为急性多发性脑梗死(血小板缺少、血管炎、肿瘤性栓塞等)；未检测出心源性脑梗死潜在病因；未发现对应颅内、外LAA病变，易损斑块狭窄面积≥50%；存在主动脉或肿瘤性栓塞潜在病因，影像学检测主动脉弓斑块>4 mm，存在血栓。排除标准：心源性因素引起的脑梗塞、关节炎、血液病、肿瘤或脑血管畸形、脑梗塞后出血、严重的肝肾疾病；弥散性血管内凝血、自身免疫性疾病、怀孕。所有受试者均签署书面知情同意书。

1.2 DPP-4基因多态性多态性检测DPP-4基因报道SNP位点中本研究选取已证实的性血管疾病相关2个突变位点，分别为rs1558965、rs1558957[14]，具体基因提取方案：肱静脉抽血4 ml，EDTA-K2抗凝，5000 RPM离心5 min后，去血清加入300 μl人红细胞裂解液，混匀震荡3 min，10000RPM离心30 s。为了消除任何悬浮的蛋白质和RNA，使用QIAamp(Qiagen Inc.，Valencia CA)进一步纯化所有DNA样品。简而言之，将400 μl保存的裂解物置于含有20 μl蛋白酶K的2 ml微量离心管中。然后将管在56 ℃温育10 min，然后加入400 μl乙醇(96%～100%)。)到样品。将来自前一步骤的700 μl混合物应用于QIAamp Spin Column并以6000×g(8000rpm)离心1 min。将QIAamp旋转柱置于干净的2 ml收集管中，并将滤液安全地丢弃。在重复离心步骤后，将500 μl AW1缓冲液加入到旋转柱中，并以6000×g(8000 rpm)离心1 min。用AW2缓冲液重复该步骤。在最后一步中，将QIAamp Spin Column置于干净的1.5 ml微量离心管中，向其中加入150 μl AE缓冲液，然后在室温下孵育1分钟，然后以6000×g(8000 rpm)离心1 min。将纯化的DNA保存在-20 ℃。通过设计来自多态性位点侧翼区域的引物并通过琼脂糖凝胶上的大小区分正常和突变等位基因来选择DPP-4多态性。设计DPP-4的引物，并由Invitrogen(中华人民共和国上海)合成。引物序列如下：5’-TGTGAATCCTTTTCCTGCTTTTC-3’(上游引物)；和5’-GCTTGCTATGGAGACCCTGAC-3’(下游引物)。聚合酶链式反应(PCR)如下进行，PCR以33 μl的总体积进行(20～60 ng基因组DNA，0.5 U Taq DNA聚合酶，10 pmol每种引物，10 mmol每种dNTP和50 mmol MgCl2。进行反应在96孔GeneAmp®PCRSystem 9700(Applied Biosystems，Foster City，CA USA)。反应条件：在94 ℃预变性5 min；然后进行35个循环的扩增，包括在94 ℃变性20 s，在55 ℃退火35 s，然后在72 ℃延伸35 s；最后在72 ℃延伸10 min。将8微升所得PCR产物用于用限制酶过夜消化，并使用4%琼脂糖凝胶电泳系统(BMA，Rockland，ME，USA)分析以确定DPP-4等位基因。G→A的变体可导致Nhe I限制性位点的出现，G→C的变体可导致Nhe Ⅱ限制性位点的出现。通过限制性内切核酸酶Nhe I(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)消化PCR扩增产物，并通过在含有0.5×Tris-硼酸盐-EDTA缓冲液(115 V，30～40 min)的2%琼脂糖凝胶上电泳检测。电泳后，使用基于紫外线的凝胶成像系统观察和拍摄这些条带。

1.3 观察指标观察DPP-4基因rs1558965(AG+GG、AA)、rs1558957(GG、GC+CC)基因型一般资料，统计其预后情况，并分析不同基因型与预后间相关性。

1.4 统计学方法采用SPSS 19.0软件处理数据。计量资料比较采用t检验或秩和检验；计数资料比较采用χ2检验；预后分析采用Kaplan-Meier生存曲线，生存期比较采用秩和检验；相关性分析采用Pearson相关分析或Spesrman相关分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DPP-4 rs1558965基因位点不同基因型基本临床资料的比较由表1可见，DPP-4 rs1558965基因位点AA基因型高血压比例、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)水平高于AG+GG基因型 (P< 0.05)；而在男性、糖尿病、吸烟史、饮酒史比例分布以及年龄水平比较上，AA基因型和AG+GG基因型相近 (P> 0.05)。

表1 DPP-4 rs1558965基因位点不同基因型基本临床资料的比较

a与AG+GG组比较，P< 0.05

2.2 DPP-4 rs1558965基因位点不同基因型预后分析由表2及图1可见，DPP-4 rs1558965基因位点AG+GG组3年生存率及生存期均低于AA组(χ2=17.89，Z=15.642，P< 0.05)。

表2 DPP-4 rs1558965基因位点不同基因型预后分析

图1 DPP-4 rs1558965基因位点不同基因型预后分析

2.3 DPP-4 rs1558965基因位点不同基因型与预后相关性分析由表3可见，DPP4 rs1558965 AA基因型与大动脉粥样硬化型脑梗死患者预后有相关性(P< 0.05)，DPP4 rs1558965 AG+GG基因型与大动脉粥样硬化型脑梗死患者预后无相关性(P> 0.05)。

表3 DPP-4 rs1558965基因位点不同基因型与预后相关性分析

2.4 DPP-4 rs1558957基因位点不同基因型基本临床资料的比较由表4可见，在男性、高血压、糖尿病、吸烟史、饮酒史比例分布以及TG、TC、LDL、年龄水平比较上，DPP-4 rs1558957 GG基因型和GC+CC基因型相近，差异无统计学意义(P> 0.05)。

表4 DPP-4 rs1558957基因位点不同基因型基本临床资料的比较

2.5 DPP-4 rs1558957基因位点不同基因型预后分析由表5及图2可见，DPP-4 rs1558957 GC+CC 基因型3年生存率及生存期与GG型相近，差异无统计学意义(χ2=0.951，Z=1.369，P> 0.05)。

表5 DPP-4 rs1558957基因位点不同基因型预后分析

图2 DPP-4 rs1558957基因位点不同基因型预后分析

2.6 DPP-4 rs1558957基因位点不同基因型与预后相关性分析由表6可见，DPP-4 rs1558957 GG、GC+CC基因型与大动脉粥样硬化型脑梗死患者预后无相关性(P> 0.05)。

表6 DPP-4 rs1558957基因位点不同基因型与预后相关性分析

3 讨论

DPP-4是一种130 kDa的免疫球蛋白(Ig)超家族成员，被认为在动脉粥样硬化的发病机制中起作用，其潜在机制可能涉及炎症。DPP-4可由CD4 + T细胞亚群，肥大细胞和B细胞分泌，其在控制感染、免疫的信号传导途径中起作用。作为炎症反应的放大器，DPP-4参与许多感染、炎症疾病，包括过敏性紫癜，支气管哮喘。DPP-4通过调节整合素介导细胞迁移并刺激整合素激活。一些研究发现DPP-4的多态性与心肌梗塞或急性冠状动脉综合征，支气管哮喘和严重疟疾有关。研究表明，支气管哮喘患儿外周血单个核细胞DPP-4 mRNA水平上调。活化的DPP-4可通过影响Th1/Th2途径介导支气管哮喘的发病机制。此外，DPP-4基因多态性也与广东人群中的鼻咽癌风险有关。先前已经研究了DPP-4(G2848A)基因多态性在霍奇金淋巴瘤发病机制中的作用，结果表明DPP-4和MyD88的多态性和单倍型与霍奇金淋巴瘤的发生有关。然而，迄今为止的研究很少关注脑梗塞的风险。rs1558965是位于DPP-4基因的密码子563的外显子8上的多态性，它导致从天冬酰胺到丝氨酸的变化。其在阳离子结合中起重要作用。通过改变CD31的结构或通过影响Ca2+依赖性细胞相互作用，取代氨基酸可以影响与整联蛋白的结合亲和力；这可能会影响涉及细胞迁移，分化或细胞凋亡的信号通路。本研究结果显示，DPP-4 rs1558965基因位点AG+GG组3年生存率及生存期均明显低于AA组，再根据结果进行相关性分析，发现Rs1558965多态性与大动脉粥样硬化型脑梗死患者预后存在相关性。

研究已证明DPP-4 SNP rs1558965与T2DM相关，并且与sDPP-IV水平的变化相关。血脂异常是T2DM的常见特征，可通过测量载脂蛋白B(ApoB)水平进行定量。最近的一项研究鉴定了南亚人群中与ApoB水平相关的DPP4基因的新SNP，发现 DPP4 rs1558965 AA基因型与ApoB水平显著相关。这在另一方面也提示，DPP4 rs1558965 AA基因型易导致ApoB水平升高，而ApoB做作为炎症的预测因子，其代谢水平与多种炎症标志物如IL-6，肿瘤坏死因子α(TNF-α)和CRP水平的增加有关。因此DPP4 rs1558965 AA基因型引起炎症因子代谢紊乱这也可能是AA基因型是大动脉粥样硬化型脑梗死患者不良预后的原因。本研究同时也探讨了DPP-4 rs1558957 GG、GC、CC基因型与大动脉粥样硬化型脑梗死患者预后的相关性，结果发现，DPP-4 rs1558957 GG、GC、CC基因型与大动脉粥样硬化型脑梗死患者预后无相关性。而这些研究结果的定论需要在排除年龄、性别等混杂因素后才能确定，这将在后续研究中进行。

综上所述，DPP4 rs1558965 AA基因型与大动脉粥样硬化型脑梗死患者预后有相关性；DPP-4 rs1558957 GG、GC、CC基因型与大动脉粥样硬化型脑梗死患者预后的无相关性。本研究仍存在一定不足之处，由于本研究尚处于初步阶段，受到时间及样本数量限制，可能在某些结果统计上产生一定偏差，因此有必要在后续研究中延长时间、扩大样本量，实施进一步深入研究。