阳离子聚合物基因载体的研究进展

张宝臻，余涧坤

(1中国医科大学第二临床学院，沈阳110004；2中国医科大学药学院)

基因治疗是将基因转染到目标细胞中，通过目的蛋白质的表达，使相应疾病状态得以减轻或纠正，最终达到治疗疾病的目的。病毒类基因载体可以将外源基因导入细胞并高效表达目的基因，是目前临床治疗采用的主要载体。但是该类载体具有较高的免疫原性，病毒组件激活还会导致病毒相关疾病的发生，而且基因组容量也有限。因此，基于临床多次给药的特点及用药安全性的要求，非病毒类基因载体更适合作为基因治疗的运载工具。阳离子聚合物基因载体是近年来非病毒类基因载体领域研究的热点,常见的阳离子聚合物基因载体有聚乙烯亚胺(PEI)、聚氨基胺(PAAs)、聚氨基酯(PAEs)和天然生物相容性高分子材料等。本文综述了这几类载体的物理化学性质、结构修饰等优化策略，总结此类载体在现阶段研究中存在的问题，为基因载体的设计和构建提供新的思路。

1 PEI基因载体

1.1 PEI基因载体的物理化学性质 PEI单体(-CH2-CH2-NH-)中每3个原子含有1个氮原子，构成具有伯胺、仲胺、叔胺基团的水溶性聚合物。这些胺基的pKa值不同，使PEI在较宽的pH范围内具有吸收质子的能力(即“质子海绵”作用)。PEI吸收H+使整个聚合物变成核正电，使得PEI具有较强结合核负电DNA和黏附细胞的能力；同时PEI吸收H+使内涵体渗透压增高，导致内涵体膜不稳定甚至破裂，有效帮助目的基因片段实现“内涵体逃逸”，避免目的基因在溶酶体内降解，才能携带目的基因片段进入细胞核。因此PEI有较高的转染效率[1]，常作为基因载体研究的阳性对照组。

PEI包载外源基因形成复合物的最佳分子量为5～25 kDa。高分子量PEI较低分子量PEI的转染效率更高，但高分子量PEI往往有较高的细胞毒性。研究发现，相近分子量的支化PEI的目的基因片段包载能力、转染效率均优于线形PEI，因此支化PEI更适宜作为非病毒类基因载体进行应用，而且PEI中伯胺基团越多则形成的基因载体复合物越稳定。

1.2 PEI基因载体的结构修饰 对PEI载体的结构修饰主要集中在优先对该类载体的末端伯胺基的修饰。研究表明，聚合物伯胺和仲胺的乙酰化修饰，能够通过降低聚合物的胞质缓冲能力和稳定性，进而增加目的基因片段在胞质中的释放；聚合物中仲胺和叔胺基团的数目越多，载体对外源基因的包封率越大，从而可能产生较高的转染效率。Thomas等[2]研究发现，用丙氨酸或十二烷基对聚合物的末端伯胺基团进行修饰，能得到高效低毒的聚合物基因载体。通过对聚合物载体进行交联或侧链修饰来引入可生物降解的具有生物响应性的化学键，会影响载体在体内的降解、消除，进而影响目的基因的释放和载体的细胞毒效应。例如:引入二硫键、亚胺键、酯键将低分子量的PEI连接起来，形成线形或分枝状结构的高分子量PEI，由于这种衍生物具有较多的可生物降解的化学键，使其在体内可降解成低毒或无毒的低分子量PEI，这样在具有较高转染效率的同时，兼顾了较低的细胞毒性。

1.3 PEI基因载体的靶向修饰 采用生物活性基团特异性配体直接修饰PEI主链，制备具有特异性靶向功能的PEI轭合物载体。除了低分子量PEI自身偶联外，另一种对PEI载体进行修饰的方法是通过引入特异性配体，通过配体间特异性的疏水作用实现聚合物各组件之间的物理吸引，从而改变其空间结构以获得高效低毒的新载体，例如PEG-生物素/生物素抗体-PEI、PEI-环糊精/棕榈酸酯-胰岛素等。Liu等[3]将低分子量PEI和肌醇(INO)交联，并与半乳糖接枝的PEG接合形成共聚物LA-PegPI，该载体显示出了优异的体循环稳定性和较低的细胞毒性，在去唾液酸糖蛋白受体阳性的肝细胞中具有高转染效率。低分子量PEI与β-环糊精和丙烷-1,2,3-三醇交联形成共聚物后，此共聚物在B16-F0细胞中使裸DNA的转染效率提高了700倍。除了B16-F0细胞，该聚合物还能在HepG2和U87细胞实现目的基因片段的高效递送，转染效率较高，细胞毒性较低[4]。因此，引入共价键的结构修饰，尤其是引入特异性配体等生物功能性基团的共价修饰在现阶段研究中仍占主导地位。

2 PAAs基因载体

2.1 PAAs基因载体的物理化学性质 溶解度是PAAs基因载体的重要性质，多数载体能够溶于水、有机溶剂，如氯仿、低级醇类及其他极性有机溶剂。PAAs在水中和有机溶剂中有一定的固有黏度，其在溶液中和同分子量的乙烯类聚合物相比有更大的流体体积，溶液中聚合物链的伸展程度更大。PAAs载体的降解速率受氨基和酰胺键数目以及空间结构的影响。鉴于此类聚合物存在上述降解特性，在进行加成聚合的过程中应注意：在聚合反应完成之前，水性介质的存在会使聚合物的分子量增加，聚合反应完成时分子量达到最大，之后水性介质的存在会使聚合物分子量下降，即加成聚合反应和酰胺键的水解反应存在竞争关系。

2.2 PAAs基因载体的结构修饰 线形PAAs包括多种具有交替酰胺基团和叔胺基团的聚合物，可通过伯胺基团的两个活性反应位点或两个仲胺基团的活性位点与双丙烯酰胺衍生物通过加成聚合反应制得。主链中的叔胺基团可以质子化，进而赋予PAAs碱性和聚合物表面的核正电及良好的水溶性。Lin等[5]合成并研究了含有不同比例仲胺和叔胺基团的PAAs，并进一步将这些氨基单体同含有二硫键的交联剂进行加成聚合，发现此类S2-PAAs具有更高的转染效率及更低的细胞毒性。Jones等[6]研究了多种线形PAAs的电荷密度、刚性对其与外源目的基因片段结合能力、结合后的稳定性、转染效率等性质的影响，结果表明，电荷密度、结构柔韧性是通过影响聚合物与核酸的结合能力及复合物胶体稳定性，来进一步影响转染效率。

在PAAs载体中引入含有二硫键的交联剂引起了基因载体研究领域的广泛关注，因为二硫键可被细胞内环境中的还原酶类降解而发生断裂，但是在胞外非还原环境中却可以稳定存在。Lin等[7]研究发现，含二硫键的支化PAAs载体比25 kDa的PEI载体转染效率更高。他们进一步研究发现，侧链基团的引入及其缓冲能力的提高能够显著提高转染效率；侧链仲胺基团的引入和氨基间隔距离的缩小，均能够提高转染效率并降低细胞毒性。Li等[8]认为，研究S2-PAAs主链中二硫键的多少只对基因/载体复合物的解聚敏感性有影响，并不是转染效率升高的主要因素。此外，Piest等[9]在PAAs载体中引入硼酸片段，发现虽然硼酸片段的引入降低了复合物粒径，转染效率有一定程度的提高，但同时也增大了细胞毒性。

2.3 PAAs基因载体的靶向修饰 对于PAAs基因载体的靶向修饰，目前的策略之一是对PEG化的聚合物中PEG链末端接上特异性配体，而这种配体能够通过加强抗体介导的细胞内吞作用，进而增加基因/载体复合物的入胞量，甚至利用配体进行特异性的细胞或组织靶向传递。Wood等[10]研究的半乳糖修饰的PEG-PAAs树枝状聚合物，在人肝细胞HepG2的体外转染实验中表现出了相当高的转染效率。

Yu等[11]设计并构建了具有多个含有二硫键的胍基化聚氨基胺(Gua-SS-PAAs)，与PEI相比表现出更高的转染效率和更低的细胞毒性。引入Gua-SS-PAAs聚合物中的胍和羧基能导致更好的核定位效应，对增强转染效率、降低细胞毒性起关键作用。Yu等[12]制备了还原敏感性及酸不稳定性的双功能PAAs，将其用于靶向肿瘤细胞、组织的基因传递，获得了一定的肿瘤组织靶向性和较好的转染效率。

3 PAEs基因载体

3.1 PAEs基因载体的物理化学性质 PAEs基因载体由于酯键容易水解，具有易降解的特性，因此细胞毒性较低。线性PAEs能溶于二氯甲烷、甲醇等有机溶剂，同时还能够溶于酸性水溶液中。研究发现，线性PAEs在pH值为5的环境中降解较慢，而处于强酸或强碱环境下几乎不发生降解。与含有叔胺的线性PAEs相比，支链PAEs作为基因载体应用存在着诸多优势：支链PAEs水溶性更好；支链PAEs中伯胺更多，质子化作用更强，包载效率更高，因此能形成粒径更小的包裹目的基因片段的纳米颗粒。此外，由于伯胺和仲胺基团的存在，支链PAEs有更大的pH缓冲能力。在一定范围内，反应时间越长，支链PAEs分子量就越大。支链PAEs在生理条件下的降解速度要快于酸性条件下的降解速度，亲水性高的支链PAEs降解速度更快[13]。同PEI基因载体一样，PAEs也具有质子海绵效应。

3.2 PAEs基因载体的结构修饰 研究发现，PAEs化学结构的差异能够导致PAEs和DNA之间亲合力的不同。聚合物和目的基因片段之间的亲合力提高，有助于增强复合物的稳定性，从而提高细胞摄取率。但是，聚合物跟目的基因片段之间的结合力如果太强，目的基因片段不易从基因载体复合物中释放出来，反而降低转染效率。研究表明，当聚合物的链长超过一定范围之后，载体的转染效率会下降，即同种载体随着分子量的增加，存在一个最佳的转染效率。Sunshire等[14]研究了PAEs疏水性和末端修饰基团对siRNA转染效率的影响，结果显示，如果PAEs合成过程中丙烯酸酯过量，最后以酯基封端，其转染效率会远小于以胺基封端的PAEs；进一步研究显示，如果采用亲水的胺基(如羟基胺)封端，PAEs具有较高的转染效率，如果采用疏水的胺基(如烷基胺、芳基胺)封端，PAEs的转染效率相对较低。

3.3 PAEs基因载体的靶向修饰 PAEs的靶向修饰包括被动靶向和主动靶向修饰两方面。被动靶向效应主要受两个因素影响，即载体表面电荷和基因载体复合物粒径。对于非特异靶向性细胞摄取，复合物表面正电荷密度越大，与细胞膜表面负电荷作用越强烈，从而越容易被转运入细胞内[15]。复合物粒径越小，细胞摄取效率越高，100 nm左右的复合物细胞摄取效率达到最佳状态。但是，当载体进行体外转染时，粒径大的基因/载体复合物可以更好地在培养基中沉淀，有助于提高体外转染效率；而对于体内基因转运过程而言，较大的复合物粒径更容易被巨噬细胞吞噬，无法到达作用靶点。因此，粒径对载体被动靶向的影响是多方面的，要结合表面电荷和粒径等因素综合考虑。

相对于被动靶向修饰，主动靶向的修饰策略更加多样化、具体化。Zugates等[16]以2-(硫代吡啶)乙胺为单体胺合成聚氨基酯，这样聚氨基酯侧链中的硫代吡啶就可以与巯基化的RGD蛋白等配体结合，使其具有靶向性。但是随着配体取代率的提高，转染效率反而下降，主要原因与配体的引入改变了聚合物的空间结构有关。随后Green等[17]放弃共价修饰的方法，转而将荷负电的蛋白质配体通过静电结合方式覆盖在载体表面，形成粒径100～200 nm的电中性基因载体复合物。结果表明，电中性的复合物在循环系统中与血浆组分的相互作用降低，稳定性提高，体内转染效率也较非特异性PAEs载体显著提高。

4 天然生物相容性高分子载体材料

4.1 壳聚糖 壳聚糖作为一种天然阳离子聚合物，通过与带负电的核酸分子以静电吸引方式相互作用，使壳聚糖-核酸体系形成包载复合物降低机体内环境中的各种因素对目的基因片段的降解，最终进入细胞。壳聚糖具有细胞毒性低、可生物降解、免疫原性低等特性，体现了良好的生物相容性，且具有抗菌、抗氧化活性及黏附特性等特点。但是壳聚糖的溶解性和靶向性较差，导致其转染率较低。

Liu等[18]将PEI通过酰胺化反应接枝到羧甲基壳聚糖的主链上，这种结构修饰提高了羧甲基壳聚糖与目的基因片段结合形成纳米结构复合物的效力,使其具有更高的转染效率和更低的细胞毒性。Peng等[19]采用甘露糖修饰的壳聚糖包载促胃液素释放肽基因质粒制备得到的纳米颗粒传递系统，该系统在小鼠体内显示出较高的转染效率，显著提高了目的基因到达巨噬细胞细胞核的数量。

4.2 葡聚糖 葡聚糖是由多个重复葡萄糖单元构成的多糖聚合物，具有良好的生物相容性，是一类良好的载体材料。葡聚糖具有很多易于化学修饰的羟基结构，已经被广泛应用于基因转染和基因治疗的研究。Tang等[20]开发了葡聚糖-肽杂交系统作为基因治疗的载体，该载体能够诱导产生更多的目的基因表达和更低的细胞毒性。

4.3 环糊精 环糊精是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，通常由6～8个葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键相接，对目的基因有很好的保护作用，且可以携带目的基因顺利跨过细胞膜。环糊精无免疫原性，生物相容性好，但很少独立作为基因载体材料使用，用PEI修饰环糊精可显著提高转染效率[21]。

5 总结与展望

选择安全、高效的基因载体是基因治疗最为关键的一步。尽管相当多的载体材料都能实现基因的有效递送，然而现有材料递送目的基因的转染效率很难超过PEI，也远未达到病毒载体的水平。低分子量和低电荷密度的阳离子聚合物一般细胞毒性也较低，但转染效率也会降低。对于阳离子聚合物基因载体的改造，可以对其进行结构修饰，主要策略集中在对伯胺、仲胺、叔胺基的修饰；另一方面可以对其进行靶向修饰，例如采用生物活性基团特异性配体来修饰基因载体。基因载体的仿生与智能设计也是未来增强基因治疗效果的有效策略之一，比如可以根据肿瘤组织的不同微环境，如低氧状态、低pH、高浓度的蛋白酶和氧化还原条件来设计和构建智能载体的尺寸和性质。此外，让载体同时递送两种或多种治疗基因的组合方法可以增强癌症等多基因相关疾病的治疗效果并降低体内细胞毒性。