SDF-1对静脉移植骨髓基质干细胞归巢作用的影响

张立霞，林青，宋冉冉，王希提

(1济南市口腔医院，济南250014；2济南市槐荫区疾病预防控制中心)

牙髓再生的目的是以新生的牙髓组织来替换因炎症或外伤所累及的炎性牙髓，利用组织工程技术实现牙髓再生是目前牙髓病治疗的主要研究方向。研究显示，通过内源性细胞的归巢可能实现类牙髓样及类牙髓-牙本质复合体样新生组织的再生[1]。近年来，细胞归巢已替代细胞移植成为牙髓再生研究的新热点。干细胞归巢是指靶器官受损后，其周围组织产生特定的微环境，该微环境诱导干细胞从细胞龛中移出，在某些特异趋化因子的作用下，迁移至受损区域，进行细胞分化从而产生治疗作用的过程。骨髓基质干细胞(BMSCs)目前已广泛用于牙周软硬组织缺损、颌骨缺损修复等口腔组织的再生修复研究中[2～4]。基质细胞衍生因子1(SDF-1)对干细胞具有强趋化作用，可与干细胞表面的特异性受体CXCR4结合形成偶联分子对，调控细胞的黏附、运动、分泌、增殖等生物学行为[5]。2016年3月～2017年3月，我们利用携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒对BMSCs进行标记，通过GFP的示踪作用，观察移植的BMSCs的归巢能力，评估趋化因子SDF-1对移植BMSCs的归巢是否存在增强作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与细胞 雄性BALB/c小鼠30只，5～7周龄，体质量(22±1.2)g，由山东大学医学部实验动物中心提供。小鼠基质ST2细胞由山东大学遗传研究所提供。

1.1.2 试剂与仪器 α-MEM培养液(Hyclone公司，美国)，胰蛋白酶(Gibco公司，美国)，胎牛血清(Hyclone公司，美国)，二甲基亚砜(Sigma公司，美国);CD34、CD44、CD45(BioLegend，美国)，CD29(eBioscience，美国)，携带GFP的慢病毒载体(上海吉凯基因化学技术有限公司)，DAB显色试剂盒(北京中杉试剂公司)，DAPI染色液(北京博奥森生物技术公司)，抗荧光衰减封片剂(索莱宝公司)，北京鼠尾胶原蛋白Ⅰ(Gibco，美国)，SDF-1(SantaCru，美国)，倒置荧光显微镜及数码成像系统(OLYMPUS，日本)。

1.2 方法

1.2.1 牙根收集 收集2016年3月～2016年7月济南市口腔医院因正畸拔除的单根管下颌第一前磨牙30颗。用快速金钢砂钻沿牙齿冠根联合处将牙根截断后，根管预备至40#根管锉(破坏根尖封闭，扩大根尖孔至直径1 mm)。使用75%乙醇清洗牙根，刮除残留的牙周膜和根尖组织。加入10% NaOCl浸泡1周。加入EDTA，PBS洗涤。将牙根置于含有青霉素和链霉素各100 μg/mL的PBS中，4 ℃保存。

1.2.2 牙根分组与SDF-1导入 分别制备2 mg/mL的中性鼠尾胶原蛋白液(3 mg/mL鼠尾胶原蛋白670 μL+三蒸水213 μL+1 mol/L氢氧化钠17 μL+ 10×PBS 100 μL)及含有100 ng/mL SDF-1的2 mg/mL的中性鼠尾胶原蛋白液(3 mg/mL鼠尾胶原蛋白670 μL+三蒸水213 μL+0.1 μg/μL SDF-1 1 μL+1 mol/L氢氧化钠17 μL+ 10×PBS 100 μL)。将牙根随机分为两份各15个，分别导入上述两种胶原蛋白液，整个过程在低温下操作。置于37 ℃培养箱孵育1 h以成胶。

1.2.3 BMSCs的鉴定与转染标记 取ST2细胞进行复苏并稳定传代，取生长状态良好的细胞，行流式细胞仪检测，以CD29、CD34、CD44、CD45四个表面分子对细胞进行联合鉴定。鉴定结果显示，检测细胞表达CD29(99.8%)、CD44(98.5%)，此为BMSCs的阳性表面标志物；不表达CD34(0.4%)、CD45(1.0%)，此为造血细胞系的表面标志物，BMSCs的阴性表面标志物。证实该细胞为BMSCs。将细胞置于6孔板中孵育24 h。加入携带GFP的慢病毒载体的悬液，作用8 h后，用完全培养基替换病毒液，并使用G418进一步纯化，获取纯度较高的GFP+的BMSCs细胞。该示踪细胞生长状态良好，细胞形态未见明显变化，细胞传代后GFP仍然表达稳定。

1.2.4 动物分组与BMSCs移植 将小鼠随机分成SDF-1组和对照组各15只。制备GFP+的BMSCs细胞悬液，密度为1×104/μL。鼠尾静脉注射器固定小鼠，将100 μL细胞悬液缓慢注入小鼠尾静脉。

1.2.5 牙根植入与标本获取 BMSCs移植后向小鼠腹膜下注射水合氯醛麻醉。用75%乙醇消毒背部皮肤，纵向切口，暴露皮下组织，形成皮下囊袋。将牙根置于皮下囊袋内，SDF-1组牙根根管内为含有100 ng/mL SDF-1的胶原支架，对照组牙根根管内为空白胶原支架，严密缝合。术后腹腔注射青霉素2 d。牙根植入3周后，采用断颈法处死小鼠。立即取出牙根，浸入4%多聚甲醛溶液，4 ℃固定24 h。冲洗标本，加入10% EDTA脱钙液中脱钙3～4个月，隔日更换脱钙液，待标本针可轻松且无阻力穿过标本时终止脱钙。

1.2.6 根管内组织学观察 将牙根沿近、远、中方向连续切5 μm厚切片，每隔5张挑出切片进行HE染色。每个牙根标本选取3张HE切片，正置光学显微镜下调至视野100倍进行观察并拍照。应用ProgRes CapturePro图像分析软件测量根管内新生组织内的血管面积，以视野内新生血管面积与整个视野面积的比值计算新生血管率。

1.2.7 BMSCs归巢细胞数目检测 倒置荧光显微镜下检测GFP+BMSCs。牙根沿近、远、中方向连续切5 μm厚切片，每隔5张挑出切片进行4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。每个牙根标本选取3张染色切片，倒置荧光显微镜下进行观察并拍照。拍照前将选取的视野固定，然后分别用蓝光和绿光激发，各拍摄图片1张。为减小误差并统一计数标准，对细胞分布呈团状者，计数为2；位于视野边缘的细胞只左侧计数，右侧不计。使用Image J2x软件进行图像分析，以视野中的GFP+细胞数与视野面积的比值(即单位面积的细胞数)计算归巢细胞数。每张切片随机选取5个视野，计算平均值。

2 结果

2.1 两组根管内组织再生情况比较 两组根管内均出现新生组织，有细胞和新生血管形成。光学显微镜下，对照组可见少量细胞和少量新生血管，以及部分残余呈网格状排列的胶原纤维；SDF-1组可见数目较多的细胞以及新生血管，胶原支架基本消失。SDF-1组和对照组的新生血管率分别为5.48%±1.02%、1.58%±0.40%，对照组较SDF-1组降低(P<0.05)。

2.2 两组归巢细胞数目比较 倒置荧光显微镜下，两组根管内的新生组织中均可观测到GFP+细胞，细胞多呈成纤维细胞样，胞质呈绿色，胞核呈蓝色。SDF-1组归巢细胞数为(5 777±426)个，对照组为(1 812±145)个，对照组较SDF-1组减少(P<0.05)。

3 讨论

研究发现，BMSCs在体外培养时具有较强的增殖能力，而在体内时基本长时间处于安定状态；但在特定的信号刺激下，其增殖与分化潜能可以被激活[6]。BMSCs的分化潜能强大，可分化为内皮细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、成骨细胞等。GFP是从水母中分离获得的示踪蛋白，它可以通过不同的载体将GFP基因与目的基因整合，整合后的宿主细胞可稳定表达GFP。倒置荧光显微镜下，用特定的光线(蓝色波长范围)激发宿主细胞会呈现绿色荧光。本实验采用携带GFP的慢病毒载体系统成功转染BMSCs细胞。转染及抗性筛选后的GFP+细胞形态未见明显变化，生长状态良好、GFP稳定表达，成为良好的示踪细胞。

组织工程强调的三要素包括干细胞、三维支架和生长因子。本实验结果显示，SDF-1组和对照组的牙根根管内均有新生组织出现，且倒置荧光显微镜下均可见GFP+细胞，表明通过小鼠尾静脉移植GFP+的BMSCs可以归巢至根管内，提示系统性的移植可能会对牙髓再生产生某种程度上的促进作用。有研究证实，通过静脉移植的BMSCs可以参与归巢，归巢至骨缺损处分化为成骨细胞并参与骨缺损的再生与修复[7，8]。目前临床应用静脉移植间充质干细胞来获取牙髓再生还不现实，但充分应用干细胞归巢原理在牙髓再生研究中具备一定的合理性，因此无论是局部的还是系统的促进干细胞归巢，都是促进牙髓再生的重要策略。

SDF-1作为干细胞迁移及归巢的主要趋化因子，由骨髓基质细胞和其他相关的间皮、上皮细胞等分泌，具有强趋化性[9]。它可以与干细胞表面的特异性受体CXCR4结合形成偶联分子对，继而通过偶联分子对的作用对细胞的黏附、运动、分泌、增殖等生物学行为进行一系列调控。Wu等[10]报道，应用外源性SDF-1可促进移植脂肪干细胞的动员与归巢，促进其向大鼠的背部创伤区迁移，进而促进背部创伤的愈合。Du等[11]报道，SDF-1可募集牙周膜干细胞归巢至牙周受损区域，从而促进牙周组织的再生。Cao等[12]建立大鼠下颌骨牵张成骨模型，发现经尾静脉移植的GFP示踪的BMSCs可以归巢至牵张区域，迁移的BMSCs细胞数目与局部应用的SDF-1浓度呈正相关。还有文献指出，骨髓间充质干细胞的动员及归巢(无论是外源性移植的还是内源性的)多依赖于SDF-1的调控[13]。

研究显示，SDF-1在浓度为100 ng/mL时可以显著提高牙髓干细胞、牙龈干细胞等干细胞的迁移能力，且随着SDF-1浓度的提高，干细胞的迁移能力并没有明显的变化，而是进入一个平台期[14，15]。本实验使用的SDF-1浓度亦为100 ng/mL。实验结果显示，虽然SDF-1组和对照组都出现了GFP+的BMSCs归巢，但SDF-1组归巢的阳性细胞数目显著多于对照组，证实了趋化蛋白SDF-1对BMSCs具有较强的调控及趋化作用，能显著提高BMSCs的归巢能力。因此利用SDF-1促进干细胞归巢，有可能成为促进牙髓再生的重要策略之一。