阿维菌素生物合成基因结构研究进展

李淑焕 薄永恒

阿维菌素生物合成基因结构研究进展

李淑焕 薄永恒*

（山东农业工程学院食品科学与工程学院 山东 济南 250100）（山东省兽药质量检验所 山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室 山东 济南）

寄生虫病是动物常见的疾病，对畜牧养殖造成比较大危害。每年，寄生虫感染动物从而造成的社会损失超过30多亿美元。从Fleming发现青霉素到现在，人们已经发现39000多种不同作用的抗生素。杀伤各种寄生虫的抗生素却不是很多，其中大多数是作用于真菌和细菌的。可以杀死寄生虫的抗生素也就只有十几种，因为寄生虫和宿主之间对抗生素敏感性一般差别小，在实际应用方面效果比较差。一般一种抗生素只能杀死一种或几种寄生虫，他们的抗虫谱也比较窄。

阿维菌素是由阿维链霉菌分泌出的一种次级代谢产物，是迄今为止发现最有效的生物杀死寄生虫的药物，是农业部推荐的一种的高效低毒的兽用药品，具有良好的应用价值和广阔的市场前景。目前，阿维链霉菌育种技术主要有自然选育、诱变育种、基因重组、代谢控制育种、基因工程育种等方法。本文主要从阿维菌素生物合成关键调控基因的研究进行探讨，为后期基因工程育种打造理论基础。

1 阿维菌素生物合成基因结构组成

（1）已知许多抗生素生物合成基因都是成簇排列的，阿维链霉菌也是如此。阿维链霉菌生物合成基因簇大约有90kb，这一部分是阿维链霉菌生物合成的关键点，其间82kb的连续区域被测通，从而获得的区域的结构如图2所示。与已知的I型多功能聚酮合酶(PKS)的模块(module)结构进行比较，红霉素[1-2]、苦霉素[3]、利福霉素[4]多功能PKS的编码模块结构都比阿维链霉菌的要简单。这个区域有18个开放阅读框(ORF)。在转录方向上，编码利福霉素PKS的10个模块和编码红霉素PKS模块方向一致，而aveA1-aveA2和ave3-ave4两部分组成了阿维链霉菌PKS的12个编码模块，但是有6个模块与另外6个模块的转录方向是相反的。其实西罗莫司的PKS的编码模块结构也和它一样的复杂，包含了按两个方向转录的10个模块和4个模块[5]。（2）4个的阅读框(open readi ng frame，ORF)是阿维菌素生物合成基因簇中最大特点，即aveA1、aveA2、aveA3和aveA4，他们连接后分成两组且相反方向转录，即aveA1-aveA2和aveA3-aveA4。结构中有4个多功能多肽AVES1(414kDa)、AVES2(666kDa)、AVES3(575 kDa)和AVES4(510kDa)，都是由PKS的基因编码而来[6]。（3）现在报道的最复杂的多功能酶系统就是这个有55个催化区存在于这4个多功能多肽中。具体的情况是这样，aveA 1和aveA 4各只编码一个结构域。首先是有把起始酰基基团加入PKS的作用的发现，就是AVES1的N-末端LD域被鉴定出来。其次，可以释放PKS上合成的聚酮的结构域被鉴定出来，就是AVES4的C-末端TE域，作用是，从而形成糖苷配基。在AVES中，每个模块中都含有以下结构域的组成之一：KS、AT和ACP；KS、AT、KR和ACP；KS、AT、DH、KR和ACP；所有的模块都含有ACP、AT和KS结构域。

2 阿维菌素生物合成关键基因

2.1 聚酮合成酶基因aveA I型PKS是合成糖苷配基也就是聚酮体合成酶的过程的特点，aveA是可以突变糖苷的，形成突变株，突变株是不产生抗生物，但可以使6，8a闭联-6，8a脱氧-5-氧阿维菌素糖苷配基转化成天然的阿维菌素。

2.2 糖基化酶基因aveB 实验研究结果表明aveB突变株只能产阿维菌素配基，因此此突变会影响糖基化阶段。推测糖苷配基糖基化转移酶能把胸苷二磷酸齐墩果糖催化为齐墩果糖，然后把这个催化产物结合到阿维菌素糖苷配基上。

2.3 C22 - C23 脱水酶基因aveC aveC的位置是在4.9kb 片段BamHI上，和aveA2相邻，转录方向和aveA2一致。文献报道aveC的突变株只产生“2”型阿维菌素，因此aveC有可能是对于1组分来说是正调控基因。研究证明阿维菌素“1”型组分与“2”型组分的不同之处仅在C22和C23键不一样，组分“1”是双键，而组分“2” 单键，且在C23位多一个羟基。而且“2”组分的前体也不是“1”组分，因为脱水是在糖昔配基形成之前发生，且C22-23脱水生成“1”组分。

2.4 C5-0-甲基转移酶aveD 文献报道突变aveD基因只产生阿维菌素B组分，是因为缺乏了阿维菌素C5-O-甲基转移酶活性，是有效组分的负控基因。该基因能催化“B”组分反应成为“A”组分。该基因可把来源于S-腺昔甲硫氨酸的甲基转移到“B”组分C5羟基上而成为“A”组分和S-腺苷-L-高半胱氨酸。AveD的分子量为64kDa。由此可见“2”组分比“1”组分先反应，Bla实际上没有活性，没必要测试。aveD位置是在3.4kb的片段BamHI上，在阿维菌素合成基因簇的左边。文献显示C5-O-甲基转移酶的活性越大，阿维菌素的产量越多。通过Ikeda等研究人员测定了突变的高产菌株的效价，随着阿维菌素产量的增加，这种酶的平均比活与最大比活性都在增加[7]。

2.5 正调节基因aveR 研究显示aveR是能编码的特异性正调控因子，其位置在aveF的下游。对其进行序列分析，aveR的产物有一个螺旋-转角-螺旋的结构，这与其他正调控因子相似，也许有一个结合位点。如果把aveR突变，阿维链霉菌就丧失了产抗的能力，当然也不会形成阿维菌素糖昔配基。相反，把这个基因超强表达一下，这个突变菌的产抗能力就会显著提高。现在文献中没有对aveR的调控机制的描述，还有待研究[8]。

2.6 关键基因orfX Hwang Yong Soon等[9]在orfX的研究中发现了包含orfX基因的8.0kbDNA片段有提高变铅青链霉菌中放线紫红素作用。研究人员做了亚克隆实验，定位了一个最小片段，它能提高产抗的关键性的，再通过序列分析，发现了最小的片段包含两个基因，orf41和orfX。通过多拷贝质粒pIJ702与包含orf41和orfX的片段构建游离表达的载体，并导入阿维链霉菌进行表达，阳性菌株产抗将得到显著提高。为了观察这个小基因的作用，用插入失活的载体，打断菌株的基因，发现菌株的产抗能力降低。但是中断株再次插入这2个基因片段，产抗能力也就恢复了。通过这2个结果显示，在orfX的单独影响下或由orf41和orfX共同影响下可以提高阿维菌素产量。

2.7 负调节基因aveR1、aveR2 Stutzman等人克隆了aveR1、aveR2两个基因，前一个基因可以控制聚酮合成酶基因的表达，后一个可以控制阿维菌素合成酶基因的表达。通过实验显示：他们2个中的一个失活或两个同时失活，都可以使阿维菌素产量大大提升。研究人员构建了的替换载体，并进行重组后，得到了缺失了aveR1、aveR2的突变株，测定效价后发现，突变株的产抗能力比原菌株提升了3.1~3.4倍[10]。

2.8 afsR2基因 afsR2基因放线紫红素的表达有重要关系，首先是在S.lividans中发现。在天蓝色链霉菌和灰色链霉菌中，AfKs/AfRs是一个双组份调节系统。自我磷酸化可以在细胞内膜发生在丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。AfsR是一种可以和核酸结合的蛋白，在其启动子区结合内，启动afsS转录必须需要AfsR的ATPase的参与，因此它是一个非常特别的的转录因子[11]。 AfsR的ATPase活性和DNA结合活性是由丝氨酶、苏氨酸残基磷酸化来调节控制的。Lee等[11]通过sourthern杂交实验，在S.avermitilis克隆到afsR2的同源基因，并将afRs2基因以多拷贝的形式引入到S.avermitilis野生菌株，研究发现引入后avermectin的产量提高了2.3倍。

2.9 nsdA基因 nsdA基因全局负调控基因，最早是在天蓝色链霉菌中发现的。对天蓝色链霉菌的抗生素的合成和产孢形态分化均有负调控作用[12]。有文献报道SC7A1是文库质粒，陶美凤等在没有质粒的天蓝色链霉菌A3(2)菌种中加入SC7A1后，菌落褶皱增加，产抗与孢子均产生的缓慢，推断表型改变的原因是这个质粒含有负调控基因。对SC7A1进行测序，发现它大约有40个基因，大小为46kb，通过亚克隆实验把前面的基因定位于oRF26，命名为ndsA(nagative regulator of streptoomyces differention)。nsdA基因中断菌的许多产抗菌的产抗能力都增加，孢子量也是原始菌的两倍。基因SAV2652是阿维链霉菌的中的一段，nsAd与之同源性达到86%，王茜等置换了阿维链霉菌中的基因SAV2652后，产抗能力提升了3.9倍。

2.10 I基因[13]因为基因AtrA和SAV4110(aveI)具有高度的同源性，所以有研究者考察了阿维链霉菌的aveI与天蓝色链霉菌中的AtrA是否一样具有促进阿维菌素生物合成的作用。实验结果发现，aveI和AtrA作用一样在生物合成中起了重要作用[14]。通过对阿维链霉菌野生菌的aveI基因敲除，产抗能力增加了16倍，说明aveI在其生物合成过程中是一个负调控因子。

3 小结

目前，Merck公司对阿维菌素及其产生菌也进行了大量的研究，对有关阿维菌素生物合成的基因已测序完成，并已克隆出全部相关基因簇，还对阿维菌素生产菌株的改造做了大量工作，获得了只产某特定组分的菌株。例如，阿维菌素B1a 和B2a选择性产出基因工程菌、阿维菌素B2a选择性产出基因工程菌、阿维菌素B1单组份缺陷突变菌株；另外，通过改良菌种，使得阿维菌素产生菌种不产生一种有毒的物质即寡霉素，从而减轻产品的毒性和提高产品的质量。随着对其基因簇的深入研究，利用阿维菌素基因工程育种手段，将大大提高阿维菌素的产量与质量。

[1] Cortes J, Haydock SF, Robert GA, et al. An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycinproducing polyketide synthase of Saccharo polysporaery thraea.[J]. Nature, 1990, 348: 176

[2] Donadio S, Staver MJ, McAlpine JB, et al. Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis. [J]. Science, 1991, 252: 675

[3] Xue Y, Zhao L, Liu H, et al. A gene cluster for macrolide antibiotic biosynthesis inStreptomyces venezuelae: architecture of metabolic diversity[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95: 12111

[4] August PR, Tang L, Yoon YJ, et al. Biosynthesis of the ansamycin antibiotic rifamycin: deductions from the molecular analysis of the biotynthetic gene cluster of Amycolatopsis mediterraneiS699. [J]. Chem Biol, 1998,5: 69.

[5] Molnár I, Aparicio JF, Haydock SF, et al. Organization of the biosynthetic gene cluster for rapamycin in Streptomyces hygroscopicus: analysis of gene flanking the polyketide synthase. [J].Gene, 1996, 169:1

[6] Ikeda H,Nonomiya T,Usami M,et al.Organization of the biosynthetic gene cluster for the polyketide anthelmintic macrolide avermectin in Streptomycetes avermitilis. Proc. Natl. Acad.Sci.USA,1999,96(17):9509-9514

[7] Ikeda H, Wang R-L,Ohta T,et al.Gene,1998,206:175~180

[8] Ikeda H, Takada Y, Pang C H,et al. Transposon mutagenesis by Tn4560 and applications with avermectin-producing Streptomyces avermitilis[J]. J Bacteriol, 1993, 175(7): 2077-2082.

[9] Hwang Y S，Kim E S，Biro S and Choi C Y.Cloning and analysis of a DNA fraglnent stulating avermectin Produetion in various StrePtomyees avennitilis strains.APPlied and Environmental Mierobiology，2003，69:1263-1269

[10] STUTZMAN-ENGWALL, etal. Streptomyces avermitilisre gulatory genes for increased avermectin production[P]. UnitedStates Patent6, 197, 5910619, 2001.

[11] Lee J Y，Hwang Y S，Kim S S，Kim E S，Choi C Y(2000)Effect of a global regulatory gene，asfR2，from Streptomyces lividans on avermectin Produetion in Streptomyces avermitilis.J Biosci Bioeng89: 602-605

[12] 应新. 天蓝色链霉菌A3(2)中nsdA的发现和生物学功能探讨[D].华中农业大学: 武汉, 2002.

[13] lei chen et al. Characterization of a negative regulator AveI for avermectin biosynthesisin Streptomyces avermitilis NRRL8165[J]. Appl Microbiol Biotechnol(2008)80: 277–286.

[14] Uguru GC,Stephens KE,Stead JA,Towle JE,Baumberg S, McDowall KJ.Transcriptional activation of the pathway-specific regulator of the actinorhodin biosynthetic genes in Streptomyces coelicolor. Mol Micro-biol2005, 58: 131-150.

2019–03–27）

S852.6

A

1007-1733(2019)07-0072-03