代谢组学分析技术在口腔软组织疾病诊断及治疗中的应用进展

孙向辉，张磊，韩涛

(天津市第三中心医院·天津市人工细胞重点实验室·卫生部人工细胞工程技术研究中心，天津300170)

代谢组学是众多组合学科研究中的一种，是通过考察生物体系受刺激后(如将某个特定的基因变异或环境变化后)代谢产物的变化或其随时间的变化来研究生物体系的一门科学[1]，其研究涉及生命科学、仪器分析及化学计量学方面的专业知识，关注的对象是生物体内分子量低于1 000道尔顿的小分子化合物。临床中代谢组学是以组群特征分析为基础，以如超高效液相色谱、超高分辨生物质谱及核磁共振(NMR)等高通量分离、检测和数据处理为手段，基于生物大数据，通过大量的计算机复杂运算，从相互比对的海量数据中提取出丰富的相关有用信息，其优点在于对于生物标本检测更容易、不需要特征化的数据库、种类少、代谢产物具有通用性[2]，文献中存在丰富的关于代谢途径和代谢物生化性质的信息[3]。近年，随着代谢组学的不断发展，其研究优势和前景被越来越多的学者所认知，目前代谢组学分析技术在各类肿瘤疾病、心肌疾病、遗传代谢疾病及感染性疾病中的应用非常广泛，但在口腔医学领域方面的应用研究仍少见。本研究中，我们就代谢组学分析技术在口腔软组织疾病即牙周病、黏膜病及口腔癌病变等诊断及治疗中的最新应用进展作以下综述，引起临床及科研工作者的关注，应用代谢组学分析技术解决口腔疾病诊疗领域亟待解决的问题，丰富口腔临床诊疗手段。

1 代谢组学分析技术在牙周病发病机制、诊断、疗效评估中的应用

牙周病是人类口腔的常见病、多发病，是牙齿脱落的主要原因。目前已公认牙周病是多因素疾病，细菌及其产物是引发牙周病必不可少的始动因子，而全身因素在牙周病的发展中属于促进因子，内分泌失调、饮食与营养状况、血液病及服用药物等因素可以降低或改变牙周组织对外来刺激的抵抗力，使之易于患病，并可促进牙龈炎和牙周炎的发展。细菌及产物局部刺激因素的影响与全身因素的调控相互联系、互为协同，或相互影响、互为拮抗。要阐明牙周病的发病机制，需了解各种因素之间的相互作用，代谢组学分析方法更接近生物学表型，反映的是已经发生的生物学事件，亦是各种因素共同作用的综合结果，是生物体系生理和生化功能状态的直接体现，更有助于找到牙周病发生发展多因素之间相互作用关系及产生机制。

1.1 代谢组学分析技术在牙周病发病机制探讨中的应用 牙周炎是最常见的口腔疾病，由宿主与口腔细菌的多因素相互作用引起。宿主和微生物的细胞代谢改变释放出许多中间产物。人们越来越感兴趣的是从口腔液体如唾液中鉴别代谢物，以加深对牙周炎复杂发病机制的理解。Chen等[4]收集健康对照组20例和广泛性侵袭性牙周炎(GAgP)患者20例，分别收集血清和龈沟液样品，用气相色谱与生物质谱联用方法测定了样品中生物标志物的相对含量，牙龈沟液样品中定性地检测到349种代谢物，并在血清样品中检测到200种代谢物。与健康对照组相比，GAgP患者血清尿素和异丙肌醇水平显著升高，谷胱甘肽、2，5-二羟基苯甲醛、己二酸和2-脱氧鸟苷水平降低。在牙龈沟液样本中，GAgP患者的去甲肾上腺素、尿苷、α-生育酚、脱氢抗坏血酸、黄嘌呤、半乳糖、葡萄糖-1-磷酸和核糖-5-磷酸水平升高，而胸苷、谷胱甘肽和核糖-5-磷酸水平降低。GAgP和健康对照组患者血清和龈沟液代谢组学有显著性差异。这些代谢特征在GAgP诊断和帮助理解其潜在机制方面具有巨大潜力。

1.2 代谢组学分析技术在牙周病诊断中的应用 代谢组学研究筛选的特征代谢物可能是早期发现和筛选牙周炎的指标，甚至可能是未来监测其预后的指标。由于当代牙周筛查方法的不足，迫切需要新的牙周筛查方法。Liebsch等[5]通过液相色谱与质谱联用的测试方法研究9例牙周炎唾液代谢轮廓，检测获得284项唾液代谢产物与口腔参数(临床附着水平、牙周探测深度、龈上菌斑、龈上结石、缺牙数量和可摘义齿)，结果显示唾液代谢组分的变化与年龄和口腔健康状况有关，牙周炎与细菌代谢产物苯乙酸显著相关，提示苯乙酸是一种很有前景的生物标志物研究物质。

Romano等[6]采集32例对照组和19例广义慢性牙周炎(GCP)患者在常规分期非手术牙周治疗前和3个月后获得未刺激的唾液,使用NMR检测方法进行代谢轮廓分析，然后采用单变量和多变量配对方法评估治疗后代谢指标的变化,结果显示GCP患者治疗后乳酸、丙酮酸、缬氨酸、脯氨酸、酪氨酸和甲酸盐水平与健康对照组相比仍存在差异。基于这些数据，NMR波谱分析显示，尽管非手术治疗后整体代谢指纹图谱发生了显著变化，但与健康个体相比，GCP患者仍保持着独特的代谢特征。Romano等[7]在更早期研究中从临床诊断为33例广泛慢性牙周炎GCP及28例GAgP患者唾液样本和39例健康对照(Hi)唾液样本中获取NMR代谢谱，采用主成分分析和NMR谱的典型相关分析相结合的方法，实现了各组间的聚类分析。结果显示Hi与GCP，Hi与GAgP代谢轮廓差异是显著的，预测准确率均达到81%，而GAgP和GCP唾液样本代谢轮廓差异并不显著，只有60%的预测准确度；与Hi组相比，GCP和GAgP患者丙酮酸、N-乙酰基和乳酸水平显著降低，脯氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸水平显著升高，以上基于唾液水平的多指标快速联合诊断为GAgP临床诊断提供了更多诊疗指标。

1.3 代谢组学分析技术在牙周病疗效评估中的应用

代谢轮廓动态跟踪分析可以为治疗方法使用或药物干预效果提供可靠的评判依据。Li等[8]利用1-氢核磁共振(1H-NMR)检测方法，观察补肾固齿丸对牙周炎大鼠血清代谢轮廓的影响，采用钢丝结扎、高葡萄糖饮食和牙龈卟啉单胞菌接种等方法建立大鼠实验性牙周炎模型，建立模型后，将31只6周龄Sprague-Dawley雌性大鼠分为5组进行补肾固齿丸给药治疗：高剂量给药组、中剂量给药组、低剂量给药组、牙周炎组和健康对照组，实验结束后处死大鼠，收集血清标本，用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)结合1H-NMR对血清中的代谢轮廓进行分析，研究结果显示5组的代谢谱显示各组个体数据集的聚类，第一主成分和第二主成分能显著区分中、高剂量组和其他组，1H-NMR谱图中显示在δ1.22 ppm、1.86 ppm、2.26 ppm、2.34 ppm和2.42 ppm的化学位移区，5组间差异最明显，相应的特征代谢产物为高密度脂蛋白、丙酮酸/草酰乙酸、精氨酸和谷氨酰胺等，补肾固齿丸对牙周炎大鼠血清代谢物的影响呈剂量依赖关系，高密度脂蛋白、丙酮酸/草酰乙酸、精氨酸和谷氨酰胺是补肾固齿丸对于牙周炎疾病能够产生有效治疗作用的血清检测指标，代谢组学分析技术为牙周炎治疗靶点的筛选及药物疗效评价提供了新的研究方向。

2 代谢组学分析技术在口腔黏膜病预防、发病机制探讨及鉴别诊断中的应用

口腔黏膜病即口腔某一部位黏膜的正常色泽、外形、完整性与功能等发生改变的疾病，主要包括复发性口腔溃疡、白塞病、扁平苔癣和慢性咽炎等。其病变种类繁多，可以组合成复杂多样的损害，有些全身性疾病也在口腔黏膜上有所表现，而有些口腔表征可作为全身疾病诊断的依据或线索。其发病因素方面，除了少数与口腔条件直接相关外，绝大多数与全身或系统因素的关系密切。随着免疫学研究的不断发展，发现与自身免疫有关的口腔黏膜病在临床上已屡见不鲜，同时及时干预潜在恶性病损，即口腔黏膜白斑病[9]及口腔扁平苔藓[10]等，可起到阻断癌变的临床效果。小分子产生和代谢产物是这一系列事件的最终结果，其能更准确地反映生物体系的状态，利用代谢组学研究方法，全面系统地对口腔黏膜病机制进行研究，找寻病因及干预靶点，将具有极广泛的科研与临床应用前景。

2.1 代谢组学分析技术在口腔黏膜病预防中的应用 Sridharan等[11]采用液相色谱与飞行时间质谱联用方法，比较了21例口腔白斑患者和22例口腔鳞状细胞癌(OSCC)患者与18例明显正常对照者的唾液代谢轮廓，结果显示在口腔白斑和OSCC中，1-甲基组氨酸、肌醇1,3,4-三磷酸、D-甘油酯-2-磷酸、4-硝基喹啉-1-氧化物、2-氧代黄嘌呤、诺可卡因-氧化亚氮、鞘氨醇-1-磷酸和假尿苷的表达显著上调；L-高半胱氨酸、泛醌、神经氨酸和戊酸雌二醇患病组下调，口腔白斑和OSCC患者的唾液代谢产物范围有明显改变。对于代谢产物个体评价在预防口腔白斑恶性转化和改善OSCC预后方面具有潜在临床应用价值。Yang等[12，13]均采用超高效液相色谱与四极杆飞行时间质谱联用方法，结合模式识别数据处理方法，比较了侵蚀性口腔扁平苔藓(OLP)患者和健康对照组的血清与尿液代谢轮廓，并用综合分析方法对扰动性代谢进行了鉴别，结果显示鉴定出的多种失调代谢产物可作为侵蚀性OLP的潜在生物标志物，其相关代谢途径及病理过程可能是该疾病的潜在防治靶点。

2.2 代谢组学分析技术在口腔黏膜病发病机制探讨中的应用 Li等[14]采集16例网状OLP患者和24例对照受试者血样，采用液相色谱与质谱联用方法对血样代谢物轮廓进行分析，结果显示共鉴定31种失调代谢产物，其影响了25种代谢途径和7种病理过程，病理网络显示，这些代谢产物参与了7个病理过程，即凋亡过程、DNA损伤与修复障碍、氧化应激损伤、碳水化合物代谢障碍、情绪障碍、炎症损伤等病理过程。网状OLP引起血清代谢物变化可能通过血液系统进一步与其他器官和系统疾病联系在一起，如糖尿病、睡眠障碍和抑郁症等。

2.3 代谢组学分析技术在口腔黏膜病鉴别诊断中的应用 Cruz等[15]采用气相色谱与质谱联用法对6例侵蚀性OLP和10例网状OLP的甲醛固定和石蜡包埋组织样品进行了代谢轮廓比较分析，显示侵蚀型和网状型两种临床变异具有明显的临床代谢轮廓特征，与网状型OLP相比，侵蚀性OLP中环己胺、甘氨酸、甘露醇/山梨醇、棕榈酸甲酯和海藻糖5种代谢产物显著减少，该研究结果提示有必要进一步使用大量新鲜组织样本进行确证。

3 代谢组学分析技术在口腔癌预防、发病机制探讨及早期诊断中的应用

口腔癌是全球最常见的头颈恶性肿瘤，其中OSCC占90%以上[16]，将近一半的患者在初诊时即已发生颈部淋巴结转移[17]。OSCC 5年生存率约50%，经早期诊断并治疗的患者5年生存率可提高至85%[18]，目前诊断口腔癌主要采取活组织病理检查，但为有创性检查，且临床普遍应用的肿瘤标志物特异性不佳，所以在筛查及早期诊断中应用受限。代谢组学研究是把异常的代谢物及相关代谢机制作为临床诊断的工具，可以使我们在“先发制人的策略中”进一步探究干预的效果(包括药物和营养)，将代谢组学带入至口腔癌研究中，探索该类疾病发生发展过程中代谢指纹图谱的变化规律，有助于揭示发病机制，找寻早期诊断标志物，找寻治疗靶点、判断预后与疾病转归。

3.1 代谢组学分析技术在口腔癌预防中的应用 Sridharan等[19]的研究利用液相色谱与四极杆飞行时间质谱联用法对口腔白斑和OSCC患者的血清代谢轮廓特征与健康对照组进行比较，结果显示口腔白斑和OSCC组的雌二醇-17-β-3-硫酸盐、左旋肉碱、5-甲基硫腺苷(MTA)、8-羟腺嘌呤、2-甲基柠檬酸、腐胺和雌激素-3-硫酸盐等表达明显高于正常对照组，此外OSCC组中5，6-二氢尿苷、4-羟基戊巴比妥洛尔葡萄糖醛酸、8-羟基腺嘌呤和腐胺的表达明显高于口腔白斑组，L-肉碱、赖氨酸、2-甲基柠檬酸、腐胺、8-羟腺嘌呤、17-雌二醇、5,6-二氢尿苷和MTA的上调提示它们在口腔白斑和OSCC中的诊断潜力，此外OSCC相比口腔白斑组腐胺、8-羟腺嘌呤和5,6-二氢尿苷呈显著上调趋势，表明以上几种代谢物具有预测口腔白斑是否发生恶性转化中的潜在诊断能力。

3.2 代谢组学分析技术在口腔癌发病机制探讨中的应用 Hsu 等[20]采用基于生物质谱的化学同位素标记定量代谢组学方法，分析31例OSCC患者癌组织和邻近非癌组织中代谢物水平的变化，利用火山图和正交偏最小二乘判别分析，找寻到OSCC中99种失调代谢物，并鉴定验证了其中的7种，利用该7种代谢物构建了一个由腐胺、甘氨酸、苯丙氨酸组成的三标记模板，利用基于接收算子特征分析的支持向量机分析器模型，将不同组织类型进行区分，同时通过代谢通路分析揭示了OSCC中多胺途径的失调。

3.3 代谢组学分析技术在口腔癌早期诊断中的应用 Mikkonen等[21]研究探讨NMR波谱在检测头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)相关唾液代谢变化方面的潜力，该研究采用1H-NMR波谱分析了从HNSCC患者(原发肿瘤位于喉部或口腔)和健康对照者身上采集的全口唾液样本，通过Mann-WhitneyU检验对可靠鉴定的唾液代谢物进行定量分析，并对测定的浓度进行分组比较，利用多变量鉴别功能分析(DFA)筛选特征代谢物组合模式，能最大限度地区分各组，HNSCC患者中1,2-丙二醇和岩藻糖浓度显著升高，而脯氨酸水平降低，在DFA模型中，当岩藻糖、甘氨酸、甲醇和脯氨酸作为组合生物标志物时，识别率最高，正确的分类率为92.1%，敏感性为87.5%，特异性为93.3%，研究结果显示唾液对HNSCC的代谢变化敏感，且易于无创收集，提示岩藻糖类物质可作为HNSCC的诊断性生物标志物。

Enomoto等[22]收集48例OSCC患者和29例口腔疾病患者的血浆样本，并用气相色谱与生物质谱联用法对OSCC患者进行了血浆代谢组学分析，筛选出壬酸、葡萄糖、半乳糖和半胱氨酸+胱氨酸等四个生物标记，根据受试者工作特性曲线(AUC)分析，其诊断OSCC的灵敏度大于90%，AUC曲线下面积大于0.9，新型代谢标志物的联合诊断将大大提升该疾病的临床诊断效能。

Lohavanichbutr等[23]采集101个OSCC、58个OPC和35个正常对照组的唾液样本，利用NMR及液相色谱与生物质谱联用法分别测试水溶液样本，同时利用液相色谱与四级杆飞行时间质谱联用方法测试脂溶性样本，结果显示OSCC和对照组甘氨酸和脯氨酸两种代谢产物水平存在显著差异，但在有或无淋巴结转移的OSCC和对照组之间，代谢产物水平没有发现任何明显的差异，其中4种代谢产物包括甘氨酸、脯氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸与早期OSCC相关，有必要进一步研究证实该实验结果。

综上所述，代谢组学研究方法以其独特的高通量检测手段及大数据基础上的生物信息分析方法等的组合技术优势，能够针对口腔疾病领域复杂生物样本类型进行检测分析，对唾液及代谢轮廓的研究不仅可以靶向关注异常代谢通路，分析牙周炎、口腔黏膜病及口腔癌的发病机制；同时其独特对生物学终末事件的关注视角，可更有效地评价药物对于牙周炎的综合治疗效果，判断口腔黏膜疾病不良转归状态，找寻口腔癌的早期诊断指标。当今世界范围内对于口腔疾病的代谢组学研究处于疾病人群横断面分析及动物模型研究阶段，国内研究进展更是鲜见，且临床应用价值尚不明确，广泛开展纵向跟踪研究及临床适用性评价前景广阔。我国广大的临床医生及科研工作者立足于我国各不同地域的人群代谢特征，开展口腔疾病的代谢组学研究，找寻疾病发生发展与环境、饮食、生活习惯等相关性，探索发病机制，筛选新型早期诊断、预后判断及病程转归标志物，找寻干预靶点，探究中医药对于口腔疾病的疗效等，必将为口腔疾病的临床诊疗带来变革与新希望。