Notch信号途径关键转录因子RBP-JK基因敲除结肠癌细胞株CT-26的体内外增殖能力观察

王淑红，王耀春

(西安交通大学第一附属医院,西安710061)

Notch信号途径在多种生物体中高度保守，并且广泛参与脊椎动物和非脊椎动物细胞的发育过程。在肿瘤的发生发展过程中Notch信号途径也被证实发挥了重要调控作用，是多种肿瘤的重要成因之一，参与胶质瘤、乳腺癌、肺癌等肿瘤的发生发展过程[1]。结肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，目前其发生机制尚不完全明确。Notch信号途径在结肠癌组织中表达升高已经得到广泛证实[2],但多数研究仅是围绕Notch信号途径的某单一配/受体探讨Notch信号途径的功能[3，4]，无法排除Notch信号途径其他配/受体之间的功能互补，可能造成所得结论存在片面性。本研究通过敲除Notch信号途径中的关键性转录因子RBP-JK，构建了RBP-JK基因敲除CT-26细胞株模型，从而实现对于Notch信号途径的彻底阻断，并观察了此细胞模型在小鼠体外的增殖能力及体内的成瘤能力，为最终阐明Notch信号途径在结肠癌发病机制中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、动物、重组慢病毒、试剂、仪器 结肠癌细胞株CT-26购自上海吉凯基因化学技术有限公司。Balb/c小鼠购自西安交通大学医学院实验动物中心，饲养于SPF级别饲养室中。重组慢病毒购自于上海吉码制药有限公司，敲除RBP-JK靶序列为5′-GGGAAGCTATGCGAAATTA-3′。5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)购自Sigma 公司。RAPA细胞裂解液，RNA 提取试剂、逆转录酶(MMLV)、TaqDNA 聚合酶、RNA 酶抑制剂等均为TaKaRa 公司产品。SYBR Premix Ex TaqTM荧光定量PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司，细胞培养液、血清及抗生素等均购自Gibico公司。Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution KiT和MatrigelTM购自美国BD公司。抗RBP-J、HES-1和actin抗体购自Abclone公司。 Calibur流式细胞仪购自BD公司，NanoDrop 2000超微量分光光度计购自Thermo Scientific公司， ChemiDoc化学发光成像仪购自BIO-RAD公司。

1.2 RBP-JK基因敲除CT-26细胞株模型的构建、鉴定 将CT-26细胞株以1×105/孔铺到24孔板中，调整细胞数量在慢病毒转染时为2×105/孔左右。第2天，用含有6 μg/mL Polybrene的2 mL新鲜培养基替换原培养基，加入适量慢病毒悬液。37 ℃孵育。4 h后加入2 mL新鲜培养基以稀释Polybrene。继续培养24 h，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。48 h更换为含有潮霉素的全培养液。流式细胞仪检测表达绿色荧光细胞比率大于95%后用于后续实验。结果显示小鼠结肠癌细胞株CT-26感染慢病毒1周后，表达EGFP的细胞比例超过95%，说明慢病毒载体已经将目的基因整合入细胞内。采用Wetern blotting法检测RBP-JK基因敲除CT-26细胞株中RBP-JK和Notch下游分子HES-1的表达，结果与对照CT-26细胞株比较，其水平显著下降。实时荧光定量PCR结果显示，与对照CT-26细胞株相比，RBP-JK基因敲除CT-26细胞株中HES-1( 1.106±0.116 VS 0.123±0.004)、Hey-1(0.951±0.105 VS 0.304±0.006)、Hey-2(0.990±0.176 VS 0.242±0.080)表达水平显著下降。说明在CT26细胞中抑制RBP-JK的表达可以有效阻断Notch信号途径。

1.3 RBP-JK基因敲除CT-26细胞株增殖能力观察 ① RBP-JK基因敲除CT-26细胞株体外增殖能力观察：采用BrdU掺入法。细胞以2×105/mL细胞数接种于直径60 mm培养皿中，培养1 d，用含0.4% FCS培养液同步化3 d，使绝大多数细胞处于G0期。终止细胞培养前，加入BrdU(终浓度为30 μg/L)，37 ℃，孵育1 h或3 h。细胞消化后，根据说明书固定破膜，给予FITC标记的抗BrdU抗体 (1∶50)避光室温染色30 min，细胞洗涤3遍后，应用流式细胞仪测算掺入BrdU的细胞百分比。② RBP-JK基因敲除CT-26细胞株体内成瘤能力观察：采用小鼠体内成瘤实验。小鼠麻醉后仰卧位固定于操作台上，动脉夹夹于肛门侧壁，沿肛门直肠方向切开7 mm 左右，使用29号针头将0.1 mL含有1×106个RBP-JK基因敲除CT-26细胞株和MatrigelTM(500 μg/mL)的PBS悬液注射于直肠黏膜下层，观察肿瘤的生长情况,注射15 d后使用游标卡尺测量肿瘤的大小，每3 天测量1次，分别记录肿瘤的长径(L)和短径(S)。肿瘤体积=L×S2×0.51。

2 结果

2.1 RBP-JK基因敲除CT-26细胞株体外增殖能力观察 RBP-JK基因敲除CT-26细胞株、对照CT-26细胞株在培养1 h时掺入BrdU的细胞比例分别为15.21%±0.242%、10.78%±0.251%,二者比较，t=31.10，P<0.01;在培养3 h时掺入BrdU的细胞比例分别为25.46%±0.316%、13.26%±0.284%,二者比较，t=70.26，P<0.01。

2.2 RBP-JK基因敲除CT-26细胞株在小鼠体内的成瘤能力观察 RBP-JK基因敲除CT-26细胞株接种后第24、27、30 天，小鼠直肠原位肿瘤体积分别为(0.351±0.014)、(0.422±0.011)、(0.737±0.021)mm3，对照CT-26细胞株接种后第24、27、30天，小鼠直肠原位肿瘤体积分别为(0.513±0.013)、(1.161±0.114)、(1.848±0.016)mm3，二者同时间比较，t分别为25.61、15.84、101.10,P均<0.01。

3 讨论

Notch信号途径是体内较为保守的信号途径之一，通过细胞与细胞间的相互作用，参与调节脊椎和无脊椎动物细胞的分化、增殖和发育过程，是维持机体内环境稳态的重要信号转导通路。目前，已有大量研究表明，体内Notch信号途径的过度活化或缺失可以导致多种肿瘤发生。

Notch信号途径有多种配体，在哺乳动物中已发现了Notch的4种受体和5种配体[5]。这些受体/配体均为跨膜蛋白，在结构上具有高度同源性。当邻近细胞表面上的Notch配体与受体结合后，释放的Notch信号途径胞内段可直接进核，通过其RAM 结构域与关键性转录因子CSL 相互作用，并募集GCN5、P300、SKIP 和MAML1 等分子共同组成转录共激活复合物，使CSL由转录抑制作用转变为转录激活作用，从而调节下游基因的表达[6]。

CSL蛋白在哺乳动物中称为RBP-JK，是Notch信号途径中的关键性转录调节因子,是介导信号传导的必需组分。由于Notch信号途径的配体有4种，在组织表达和功能上存在着较大的交叉和互补。为了实现对于Notch途径的完全阻断，本研究则以Notch信号途径的关键性转录因子RBP-JK作为阻断对象。通过病毒干扰抑制RBP-JK的表达水平， Notch信号途径下游主要基因HES-1和Hey-1,2的表达水平受到了明显的抑制，提示Notch信号途径发生彻底阻断，说明针对RBP-JK表达的干扰和抑制可以较好地弥补Notch信号途径不同配/受体间的相互影响，是研究Notch信号途径功能的理想模型。

Notch信号途径参与调控结直肠的生理性发育过程，能够促进肠道正常结构和组织极性的生成，是其维持结直肠稳态和发挥功能所必需的关键性调控途径。Notch信号途径在结直肠组织的异常表达必将引起其干祖细胞的发育分化异常，导致肠道结构紊乱和功能失调，最终诱导肿瘤发生。在结肠癌的研究[7]中发现, Notch信号途径的基因呈现高表达状态, 提示在结肠癌的发生中Notch信号途径作为促癌基因发挥作用。Qiao等[8]研究表明，结肠癌组织中Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3、DLL4以及Notch信号途径的多种受体和下游靶分子的表达水平都高于对照组，说明其参与调控肿瘤形成和转归的过程。Miyamoto等[9]研究显示，Notch信号途径的抑制剂GSI可以显著减少AOM诱导形成的小鼠结肠肿瘤数量，肿瘤组织中KLF4和p21表达水平显著升高，Ki67表达减弱，细胞增殖受到抑制。Meng等[10]研究表明，在原位结肠癌发生的过程中Notch信号途径被显著激活，但在结肠癌发生转移时作用并不明显，提示Notch信号途径对于结肠癌发生和进展的调控作用主要在结肠癌发生的早期。然而，在结肠癌转移瘤组织中Notch1和HES-1的表达水平高于正常组织和原位结肠癌组织，说明Notch信号途径在结肠癌的进展期和晚期也发挥了十分重要的调控作用[11]。Notch3通过调节Numb抑制分子Msi-1的表达可以促进小鼠体内结直肠肿瘤的发生和进展[12]，在结肠癌细胞系中抑制Notch3表达，细胞在小鼠体内形成肿瘤的能力明显减弱[13]。本实验结果也显示，通过抑制RBP-JK的表达实现完全阻断Notch信号途径后，掺入BrdU的CT-26细胞百分比无论是培养1 h还是3 h均有显著的下降，说明Notch信号途径是CT-26细胞体外增殖所必需的信号通路。进一步的体内成瘤实验结果表明，阻断Notch信号途径的CT-26细胞在小鼠体内成瘤速度较慢,说明Notch信号途径参与CT-26细胞体内外增殖的调控。

综上所述，Notch信号途径阻断后结肠癌细胞株CT-26增殖能力减弱。Notch信号途径与结肠癌细胞株CT-26增殖有关，是结肠癌细胞体内外增殖的重要调控元件。但本研究只在细胞层面探讨了Notch信号途径在直肠癌发生中的作用，更加深入的分子机制需要在实验动物模型和临床样本中加以探讨和验证。