蒲公英水提液抗病毒有效部位筛选及体外抗病毒作用观察

谢士敏，刘英男，刘子皓，周长征

(1山东中医药大学，济南250300；2山东中医药大学药学院)

蒲公英为菊科植物蒲公英TaraxacummongolicumHand.-Mazz.、碱地蒲公英Tarxacumborealisinense Kitam.或同属数种植物的干燥全草；味苦、甘，性寒；有清热解毒、消肿散结、利尿通淋等功效，在疔疮肿毒、乳痈、瘰疬、目赤、咽痛、肺痈、肠痈、湿热黄疸、热淋涩痛[1]等病症中经常运用。现代药理学数据研究统计显示，蒲公英具有抑菌[2，3]、抗肿瘤[4，5]、抗氧化[6]、降血糖[7]、抗炎[8]、利尿[9]、调节免疫等多项功效，此外，蒲公英煎剂或水提物能缓解延迟疱疹病毒引起的病变[10～12]。蒲公英中属植物的化学成分复杂而多样，截至目前，在蒲公英中分离出的有黄酮类、萜类、酚酸类、甾醇类、香豆素类、挥发油类等化学成分[13]。目前蒲公英抗病毒领域的研究还比较少，其具体抗病毒成分仍未明。2018年2月～2019年3月，本研究选取肠道病毒-71(EV-71)病毒，采用病毒示踪法对蒲公英抗病毒有效部位进行筛选并对其体外抗病毒作用做出探讨。

1 材料与方法

1.1 蒲公英、病毒株、宿主细胞、试剂及仪器 中药蒲公英(购于吉林国安药业有限公司)。病毒株与宿主细胞：呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒(HSV)、EV-71病毒引自中国疾病预防控制中心病毒病研究所流感病毒研究室，猴胚胎肾细胞(MA104)由山东省医学科学院基础医学研究所微生物室所提供。主要试剂：1640细胞培养液(美国GIBCO产品，含质量分数为10%新生牛血清及100 μL/mL青霉素和链霉素)；PBS磷酸盐缓冲溶液(自制)(含 NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.2 g，Na2HPO42.9 g，加三蒸水至 1 L，过滤除菌，并分别储存，置 4 ℃ 保存备用)；EDTA-0.25%胰酶(Amresco公司)；0.1%中性红染料(上海化学试剂三厂)。主要仪器：D101型大孔树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)；CO2细胞恒温培养箱(美国FOMAS公司)；CO2病毒恒温培养箱(上海跃进医疗器械一厂)；高速台式离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)；CKX-31倒置显微镜(Olympus公司)；荧光倒置显微镜(Olympus公司)；MK3酶标仪(Labsystems公司)。

1.2 蒲公英不同样品的制备 ①蒲公英水提液的制备：采用蒸馏水回流提取法。称取蒲公英药材50 g，利用蒸馏水进行两次提取，提取时间和料液比例分别是2 h、1∶10与1.5 h、1∶8；然后趁热抽滤，合并滤液，把滤液减压浓缩至50 mL，并将其置入EP管中，并贴标签备注样品A。② 样品A醇沉样品的制备：量取上述水提取液40 mL，其次将其缓慢加入体积分数为95%的乙醇并迅速搅拌至完全溶解，将乙醇浓度调节至50%，然后冷藏静置24 h、抽滤、向滤饼中加入适量水超声溶解，并浓缩至质量分数为1 g/mL，最后将其装入EP管中，上清液和沉淀溶解液分别贴标签备注样品B、样品C。③样品B、C醇化液的制备：参照王鹏飞等[14]的实验方法，进行D101大孔树脂的预处理。处理完成后进行上样。把蒲公英水提醇沉后的沉淀物溶解液加入到已装好的大孔树脂柱中，确保药液液面高于树脂柱上表面2 cm，静置吸附0.5 h；然后用蒸馏水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇洗脱至无色，在洗脱过程中流速控制为3 BV/h，每一瓶接200 mL洗脱液；最后浓缩至含药量1 g/mL，装入EP管中，每个样品分别标记：水X部位，25%乙醇X部位，50%乙醇X部位，75%乙醇X部位，X为每瓶洗脱液收集的次序。

1.3 样品A、B、C体外抗病毒试验法 参照颜娓娓等[15]的试验方法，进行MA104细胞的复苏、培养以及RSV、HSV、EV-71三种病毒的扩增。

1.3.1 病毒毒力的测定 用 2% 维持液将病毒液做10倍比系列稀释，纵向重复3孔，横向依次接种在96孔板内单层细胞上，37 ℃、5% CO2培养，细胞出现病变者判为药物毒性，终止培养，中性红染液染色后，用酶标仪在540 nm波长条件下测定OD值。结合Reed-Muench公式计算病毒液的半数感染浓度(TCID50)。细胞存活率=各组OD值/正常细胞OD值×100%，细胞病变率=1-细胞存活率，细胞比距= (高于50%病变率-50%)/(高于50% 病变率-低于50%病率)×100%，TCID50=Antilog(log高于50% 病变率病毒稀释度+ 细胞比距×稀释因子对数)。

1.3.2 蒲公英样品细胞毒性及其抗病毒活性观察 ①蒲公英样品半数中毒浓度(TC50)的测算：将样品用2% 1640维持液按2倍比稀释12个浓度梯度，依次接种于已经长成单层MA104细胞的96孔板中，并设3个复孔，同时设置细胞对照组。置于37 ℃、5% CO2病毒培养箱中培养，在倒置显微镜下观察，当细胞出现90%病变时终止培养。将96孔板中的培养液吸出，每孔加入中性红染液50 μL，放入培养箱中反应1 h取出，倒出中性红染液，用自来水冲洗5遍，每孔加入100 μL脱色液，恒温箱放置15 min，用酶标仪在540 nm波长下测定OD值。结合 Reed-Muench 公式计算药物半数中毒浓度(TC50)，并确定药物最大无毒浓度(TC0)。本实验以细胞存活率≥90%的药物浓度作为药物最大无毒浓度。TC50= [Antilog ( log 高于50% 病变率病毒稀释度-细胞比距)]×C首孔药物浓度。②蒲公英样品半数有效浓度(EC50)和治疗指数(TI)的测算：将样品用2%1640维持液分别进行2倍比稀释，共12个稀释度，按稀释度顺序以每孔50 μL横向接种于长成单层的MA104细胞的96孔板中，每孔再加50 μL用2% 1640稀释过的病毒，设3个复孔，同时设病毒对照和细胞对照组。置于37 ℃、5% CO2病毒培养箱中培养，每日观察病变。用倒置显微镜观察，当病毒对照组出现90%以上病变时，终止培养。将96孔板中的培养液吸出，每孔加入中性红染液50 μL，放入培养箱中反应1 h取出，倒出中性红染液，用自来水冲洗5遍，每孔加入100 μL脱色液，恒温箱放置15 min，用酶标仪在540 nm波长下测定OD值。结合Reed-Muench公式方法计算EC50和TI。EC50=[Antilog(log高于50%存活率药物稀释度的值-细胞比距)]×C首孔药物浓度，TC50=[Antilog(log高于50%病变率药物稀释度的值-细胞比距)]×C首孔药物浓度，TI=TC50/EC50，当TI≥4时，则认为药物具有抗病毒活性，否则无效。样品A结果： RSV病毒TC50、EC50、TI分别为 2-4.6、2-8.7、17.15，EV-71病毒TC50、EC50、TI分别为2-4.8、2-11.0、73.50，样品对HSV病毒无抑制作用。说明样品A对RSV病毒和EV-71病毒均有一定的抑制效果，对EV-71病毒有着明显的抑制作用。经过初步筛选，选用EV-71病毒进行下一步样品B、C抗病毒有效部位的研究。

1.4 样品B、C抗病毒有效部位的筛选 样品B、C分别进行体外抗EV-71病毒实验，方法同1.3。用酶标仪测定OD值，计算TI值。样品B体外抗EV-71病毒的TC50为2-4.5，TI值显示无效。样品C体外抗EV-71病毒的TC50、EC50、TI分别为2-4.4、2-10.2、55.72，提示样品C对EV-71病毒有良好的抑制性。样品B对病毒没有抑制效果，故选用样品C进一步探究其抗病毒具体部位。将样品C溶解后过D101大孔吸附树脂，分别以蒸馏水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液后进行体外抗EV-71病毒实验。最终样品D作为研究样本初步探究蒲公英体外抗EV-71病毒的作用。

1.5 样品D抗EV-71病毒作用观察 参照袁琦等[16]的实验方法，设置抗病毒作用中的预防作用组、直接杀灭作用组、病毒穿入细胞后的阻断作用组。

1.5.1 样品D抗EV-71病毒预防作用观察 样品D从无毒浓度起，用2%1640维持液进行2倍比稀释，共12个稀释度，按稀释度顺序以每孔50 μL横向接种于长成单层的MA104细胞的96孔板中，2 h后，用PBS进行清洗，每孔再加入50 μL 100倍TCID50浓度的病毒液，并设3个复孔，同时设置细胞对照组和病毒对照组[16]。后续培养方法及TI值测定方法同1.3.2②。

1.5.2 样品D抗EV-71病毒的直接杀灭作用观察 样品D从无毒浓度起，用2%1640维持液进行2倍比稀释，共12个稀释度，与等体积100倍TCID50 浓度的病毒液相互作用2 h，每孔50 μL横向接种于长成单层的MA104细胞的96孔板中，并设3个复孔，同时设置细胞对照组和病毒对照组。TI值测定方法同1.3.2②。

1.5.3 样品D对EV-71病毒穿入细胞的阻断作用观察 向已经长成单层的MA104细胞的96孔板中加入50 μL 100倍TCID50浓度的病毒液，2 h后，用PBS清洗，将样品D从无毒浓度起，用2%1640维持液进行2倍比稀释，共12个稀释度，每孔50 μL接种，设3个复孔，同时设置细胞对照组和病毒对照组。TI值测定方法同1.3.2②。

2 结果

2.1 蒲公英样品C经不同溶剂洗脱后抗EV-71病毒有效部位的筛选结果 水1部位TC50、EC50、TI分别为2-5.0、2-11.2、73.52，水2部位分别为2-4.7、2-9.7、32.00，水3部位分别为2-4.5、2-8.6、17.15，水4部位分别为2-4.9、2-8.1、9.19。水4、5、6、7、8部位无抗病毒作用。25%乙醇1部位TC50、EC50、TI分别为2-4.6、2-8.0、10.56。25%乙醇2、3、4、5、6、7部位无抗病毒作用。50%乙醇1部位TC50、EC50、TI分别为2-3.5、2-6.3、6.96。50%乙醇2、3、4、5、6部位无抗病毒作用。75%乙醇1、2、3部位无抗病毒作用。样品C经D101型大孔树脂吸附后的水1洗脱部位(样品D)为抗EV-71病毒最有效部位。

2.2 样品D的抗EV-71病毒机制 预防作用组TC50 、EC50 、TI分别为2-2.5、2-6.9、24.25。阻断作用组TC50 、EC50 、TI分别为2-2.2、2-4.6、5.28。直接杀灭组无抗病毒作用。预防作用组TI值大于阻断作用组(P<0.05)。

3 讨论

EV-71病毒是引起手足口病最为常见的病毒之一。人类作为EV-71病毒惟一的自然宿主，感染后容易引发肺水肿、心肌炎、无菌性脑膜脑炎等严重并发症，更为严重者甚至死亡。目前临床上治疗EV-71病毒感染的疾病主要药物是利巴韦林。但利巴韦林毒性大，会逐渐产生耐药性。中药具有不良作用小、广谱抗病毒、作用靶点多、价格低廉、药源丰富等优点，因此，寻找对病毒有效的中药为近年研究热点。

蒲公英作为一种药食同源的药物，其化学成分主要有黄酮类、植物甾醇类、香豆素类、倍半萜类、挥发油类、多糖类等，在临床上主要应用于呼吸系统感染、皮肤病、胃肠道疾病、糖尿病、妇科病等疾病，已经成为科研界关注的焦点，蒲公英的多种药理活性与化学成分的研究为新的天然药物开发提供了药理学依据[16]。查阅国内外文献发现，蒲公英具有抗流感病毒和人类免疫缺陷病毒(HIV)的活性。He等[17]研究发现蒲公英水提物的一个或多个组分具有抗流感病毒的特性，其作用机制主要是抑制病毒复制。Han等[18]研究发现，蒲公英提取物具有抗HIV-1复制和抑制逆转录酶活性的作用。目前，国内外对蒲公英抗肠道病毒的研究未见报道。本研究通过体外抗病毒实验对蒲公英水提液(样品A)抗病毒的有效部位进行初步筛选，确定其最敏感菌株为肠道EV-71病毒，采用水提醇沉法进一步对样品A分离纯化，得到样品B(上清液)和样品C(沉淀)，发现沉淀部位具有抗病毒活性。再进一步通过大孔树脂吸附的方法进行纯化，得到不同洗脱部位的样品，最终确定其最有效部位为经过50%乙醇醇沉后，沉淀部位溶解后经D101型大孔吸附树脂吸附，水1洗脱部位。本研究中利用蒸馏水回流提取法制备蒲公英水提液，可以将其黄酮类、多糖类等成分提取出来，研究发现黄酮类和多糖类物质均具有一定的抗病毒活性，提示此提取方式适合其抗病毒研究。样品C经D101大孔吸附树脂吸附，并选择不同梯度的极性溶剂进行洗脱，可以将活性成分分离纯化，并有效去除杂质，从而进一步研究其抗病毒有效物质。

对蒲公英最有效部位体外抗病毒作用进一步探究发现蒲公英体外抗EV-71病毒机制中的预防作用要明显优于病毒穿入细胞的阻断作用，可以推测蒲公英可以提高细胞的免疫能力，对EV-71病毒的穿入有一定的抑制作用，减弱了病毒对细胞的进攻，但在细胞内无直接杀伤作用。将病毒和药物直接作用时，TI值显示无效，进一步说明了蒲公英对EV-71病毒无直接杀灭作用。宋宝辉等[19]探讨了蒲公英及其多糖提取物对免疫功能低下小鼠的影响，发现蒲公英及其多糖提取物具有上调机体免疫功能低下的作用，说明蒲公英可以提高细胞的免疫力。国内对中草药抗EV-71病毒机制的研究发现，其具有直接杀灭病毒的作用。王春阳等[20]通过MTT染色法探究了鱼腥草对EV-71病毒的活性，发现其在体外具有与利巴韦林相当的抗EV71病毒复制的活性，并且鱼腥草可以直接灭活EV-71病毒。由于中药抗病毒具有多成分、多环节、多靶点的特点。蒲公英水提液抗EV-71病毒作用机制较为复杂，并不是针对于病毒感染的某一单一环节，可能是药物对细胞和病毒的多种功效共同发挥作用，其抑制病毒感染的详细机制，需要进一步试验验证。尽管病毒的整个复制周期尚未完全研究清楚，但其关键步骤主要包括病毒吸附、穿入、生物合成、复制、装配与释放几个过程，这些关键的步骤都可成为抗病毒药物研究的作用靶点[21]。

综上所述，蒲公英水提液具有良好的抗EV-71病毒活性，其抗病毒最有效部位为经过50%乙醇醇沉后，沉淀部位溶解，经D101型大孔吸附树脂吸附，水1洗脱部位。蒲公英最有效部位体外抗EV-71病毒作用中的预防作用优于病毒穿入细胞的阻断作用，对EV-71病毒并没有直接杀灭作用。本研究也为进一步分离、纯化、筛选出蒲公英抗EV-71病毒作用的有效单体提供了实验基础。