慢性Ⅲ型前列腺炎患者前列腺液中纳米细菌的检测

杨 彬，王靖宇，郭 强，张文瑾，袁 帅，张雁钢

（山西医学科学院山西大医院，山西太原030032）

慢性前列腺炎是泌尿科门诊的最常见病之一，其中Ⅲ型前列腺炎（CPPS）占前列腺炎的90%以上，常规检测只发现部分患者存在感染证据，而部分患者又合并结石和钙化，其确切病因至今存在许多学说［1]，在是否使用抗生素等治疗方法上更是方案众多，缺乏规范。近来发现纳米细菌的存在与Ⅲ型前列腺炎有密切关系，一些患者前列腺液中检测出纳米细菌（NB）［2]。纳米细菌不仅可以引起炎症，而且有钙化作用，与部分前列腺炎患者病变情况相似。本研究通过对临床78例Ⅲ型前列腺炎患者前列腺液进行检测，了解其具体感染情况。1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2011年12月-2016年12月在本院泌尿外科门诊经Meares-Stamey四杯法筛选的78例Ⅲ型前列腺炎患者，年龄21～44岁，平均30.5岁，病程6～36个月，均符合美国国立卫生院（NIH）制定的前列腺炎诊断标准［1]。共同具有以下临床特征：盆腔区域疼痛或不适至少持续3个月以上，可伴排尿和性功能症状，前列腺局部可为炎性或非炎性，前列腺液WBC增高或正常，尿常规正常。排除标准：前列腺增生、前列腺癌、尿道结核、泌尿系结石等以及有严重内科等疾患，1 w内未服用抗生素。75例正常健康男性的前列腺液作为正常对照。用尿道口消毒后行前列腺按摩，取1～2mL前列腺液（EPS）无菌保存备用。

1.2 研究方法

1.2.1 标本处理 每份EPS标本用生理盐水稀释5倍，使用0.45m滤器过滤，离心后取管底1mL加入5mL生理盐水再次充分稀释，使用0.22 m滤器再次过滤，离心后取管底1 mL作为成前列腺液检测原液。之后分别进行培养、间接免疫荧光染色及PCR扩增。

1.2.2 纳米细菌的培养 取上述制备的检测原液200μL加入3～4mL含无菌处理的RPMI 1640培养基中，置于37℃、5%CO2条件下培养4 w，用相同的RPMI 1640作阴性对照。培养中严格注意操作技术，定期观察并记录细菌的生长情况。

1.2.3 纳米细菌的鉴定 分别利用下述二种方法进行鉴定：①间接免疫荧光染色（IIFS）：将1滴检测原液滴到透明玻片后自然晾干，用4%多聚甲醛固定15min，灭菌水洗后 70℃10min。滴加一抗（鼠抗纳米细菌单克隆抗体8D10）0.1 mg/mL，37℃孵育60min，PBS冲洗3次。滴加二抗（FITC标记山羊抗小鼠IgG）0.03mg/mL，37℃孵育40min，再次冲洗3次，2min/次。80%甘油封片，置于荧光显微镜下观察。②PCR检测：将上述制备的检测原液盐酸处理后，加入Tris碱中和，离心后沉淀进行PCR扩增。根据纳米细菌16sRNA基因序列合成一对引物：5′-aacgaacgactgggggcggcaggc-3′，5′-caccccagtcgctgaccc-3′。反应体系：上下游引物各1 μL，Taq酶（Takara）1 μL，总体系 301 μL，进行PCR。反应结束后将产物进行凝胶电泳检测。

2 结果

2.1 培养液观察结果

培养2 w后部分培养管底部出现紧贴管壁的白色沉淀，部分培养管下部出现浑浊。继续培养和观察至4 w，10例肉眼可见为沉淀于管底的白色物，15例可见白色或浅黄色絮状物。而其余53例、正常男性对照和对照的RPMI 1640组中均未观察到沉淀或絮状物。取少量沉淀或絮状物常规染色，光学显微镜观察未见典型细菌或真菌。

2.2 纳米细菌的鉴定

①间接免疫荧光染色法检测结果：8D10是小鼠的抗纳米细菌单克隆抗体，可以与纳米细菌发生特异性结合，在荧光显微镜观察可见绿色的球杆状或球状颗粒，表明阳性结果，提示有纳米细菌。78例样本纳米细菌IIFS法检测有31例为阳性，其阳性检出率为39.7%，正常男性对照组无阳性。②PCR法检测结果：利用PCR法扩增检测纳米细菌特异性16sRNA基因，目标基因大小为1406 bp，因此在1 400 bp左右见阳性可见特异性条带。78例样本中有37例纳米细菌PCR检测阳性，其阳性检出率为47.4%，正常男性对照组有5例为阳性，其阳性检出率为6.7%。与IIFS比较，PCR 法的阳性检出率高（P＜0.05）。

3 讨 论

慢性前列腺炎是泌尿科门诊的最常见病之一，其病因至今仍不清楚，其诊治已成为国际泌尿界的难题。其中Ⅲ型前列腺炎（CPPS）占前列腺炎的90%以上。其特殊性有：①虽然常规检查及培养无菌，但前列腺确实存在炎症或炎症标记物阳性；②前列腺中经常发现结石或钙化；③多数抗生素治疗能够取得一定效果，但难以治愈。这些特点提示我们可能有不被认知的感染性病因存在。另一方面，由于前列腺炎患者人数非常众多，目前诊疗存在大量误区，主要有：①过度诊断：某些医疗机构和医生出于赢利目的，将多数不相关的疾病和症状（如勃起功能障碍、早泄、精液不液化、弱精子症等）盲目冠以“前列腺炎”，既增加了患者的经济和心理负担，也延误了原发疾病的治疗；②过度治疗：其中主要为大量、长期、反复地盲目使用抗生素，结果是耐药细菌越用越多，费用高昂，而病情仍未缓解。因此如何明确前列腺炎的发病机制，使治疗“有的放矢”是目前前列腺炎诊治的关键问题所在。

纳米细菌的发现及其致病特点为阐明前列腺炎的病因提供了全新的切入点，纳米细菌为近年发现的能通过100 nm滤菌器的特殊革兰阴性菌，能引起组织的炎症。1992年Kajander EO在一种具有细胞毒作用的生物膜发现了一种革兰染色阴性的颗粒，这些颗粒被命名纳米细菌［3]。这是一种球杆状或球状微小病原，基因序列为16sRNA，广泛地存在于人体内，前列腺、尿液、血液及其他许多器官系统已证实存在纳米细菌。纳米细菌多数处于一种类休眠状态，周围形成钙化壳包绕，可以有效对抗机体免疫细胞的识别和普通抗生素的杀灭，表现为正常机体产生的一种钙化物，因此纳米细菌可以在体内长期持续存在。只有当一定条件下纳米细菌分解其具有毒性生物膜时，才会被机体免疫系统开始识别，出现复活后的细菌炎性反应。人体泌尿道排泄是纳米细菌的主要出路，除四环素类外大多数抗生素对纳米细菌不敏感。本试验利用不同方法对CPPS患者前列腺液中纳米细菌进行检测，发现纳米细菌在Ⅲ型前列腺炎患者中存在较高的阳性率，推断其是引起前列腺组织炎性改变的重要原因。

纳米细菌生长非常缓慢，每次繁殖需要3 d左右，4 w左右才能得到培养结果，因此常规培养如同结核杆菌等一样非常耗时，影响指导临床诊断和治疗，需要准确和快捷的手段来协助前列腺炎的诊治。目前研究者公认抗纳米细菌单克隆抗体8D10可以结合纳米细菌外膜特异的糖多肽和通道蛋白，具有特异性并用于纳米细菌的鉴定［4－5]。另外间接免疫荧光法也是公认的纳米细菌鉴定基准，直接鉴定阳性率较低，而培养后间接免疫荧光鉴定可以明显提高阳性率，但培养同样需要4 w时长［6]。因此本研究选择通过培养、间接免疫荧光法和PCR法，检测Ⅲ型前列腺炎患者前列腺液中纳米细菌，间接免疫荧光法检出率较低，PCR检测纳米细菌16 s rRNA基因的阳性率提高［7]。PCR技术由于其高敏感性和准确性，常用于培养周期长和数量微少的病原微生物，如衣原体、支原体和结核杆菌。PCR法检测纳米细菌感染比传统培养方法能大幅度减少检测时间，给患者提供及时对症治疗，而相比培养前间接免疫荧光法检测的敏感性明显提高，减少了纳米细菌漏诊，综合评价PCR是一种快捷有效和准确的检测手段，对于Ⅲ型前列腺炎纳米细菌感染的判断具有重要价值。