肿瘤肺转移建模方法及应用概述

李丹宇 周黎明

(四川大学华西基础医学与法医学院基础医学，华西基础医学院药理教研室，四川 成都 610041)

恶性肿瘤已成为全球仅次于心血管疾病的死亡原因，据国际癌症研究机构研究估计，2018年，全球范围内将会有1810万癌症新发病例和960万癌症死亡病例。对于整体人群来讲，肺癌是最常见的癌症类型(占整体的11.6%)，也是癌症死亡的主要原因(占癌症总死亡数的18.4%)[1]。其中，根据我国2014年登记数据，全国恶性肿瘤新发病例数380.4万例，死亡病例229.6万例。临床上，部分患者癌症在发现时已经发生转移，其成为患者死亡的主要原因。肺是恶性肿瘤转移最高发的器官，全身组织器官的肿瘤基本都可以通过血行播散、淋巴道转移或邻近器官直接侵犯转移到肺。由于目前肿瘤转移确切机制尚不明确，针对其有效靶向防治手段的缺失，故建立理想的实验动物模型，成为研究肺转移瘤分子机制、防治方法等的重要部分。本文对现有的肿瘤肺转移实验动物模型进行综述，从建模方法、实验动物品系、肺转移率等方面分析比较五种建模方法的优缺点，并对其最新应用进行概述。

1 尾静脉注射法

尾静脉注射法即将肿瘤细胞悬液通过尾静脉直接注入小鼠体内，其为目前应用最广泛的建模方法。

1.1 乳腺癌

在对乳腺癌肺转移进行研究时，给C3H小鼠(4～5周龄)尾静脉注射C3H小鼠非自发性乳腺癌细胞悬液，细胞数为2*106个/只，d15开始，模型组小鼠的体重开始呈下降趋势，d30模型组小鼠未见死亡，肺转移率87.5%，肉眼可见肺部清晰转移灶[2,3]。龚宏霞[4]等用Balb/c裸鼠(雌性，6周龄)建模，同样有较高肺转移率(100%)。将小鼠乳腺癌4T1-luc细胞悬液1*105个/只，尾静脉注入，21d后肺组织包埋切片，病理组织学诊断为浸润性癌。曹让娟[5]等用SCID小鼠(雌性，4～6周龄)建模。因人乳腺癌MDA-MB-231细胞株形成的肺转移为肺部弥散性浸润难以量化评价，故用其稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞系：MDA-MB-231-GFP。以细胞数1.5*106个/只，将细胞悬液尾静脉注入小鼠体内。5周后，肺部的转移灶在488 nm 激发光波长下呈现绿色, 表明自发性肺转移模型成功建立。

1.2 肝癌

对于肝癌肺转移模型，将小鼠肝癌H22细胞悬液1*106个/只，尾静脉注入Balb/c小鼠(雄性，5～6周龄)。14d后小鼠存活率100%，肺转移率100%，肿瘤转移灶直径在220μm左右，全肺平均转移灶数为23个[6]。Ogawa[7]等用KSN裸鼠(雌性，8～10周龄)建模，他们分离出N1、L2、C2、C6、C1、C5F，6种小鼠肝癌细胞分别建模进行优劣对比，尾静脉注射细胞悬液细胞量为1*106个/只，5～6周处死。其中N1细胞(100%，肺转移灶48.8±43.7个/cm2)、L2细胞(100%，肺转移灶15.3±4.0个/cm2)造模成功率最高，C2细胞(67%，肺转移灶4.7±5.5个/cm2)、C6细胞(25%，肺转移灶1.6±2.9个/cm2)次之，C1细胞、C5F细胞肺转移率为0。

1.3 黑色素瘤

李佳悦[8]等选用C57BL/6(6～7周龄，黑色)、KM(6～7周龄，白色)两种品系的小鼠进行小鼠黑色素瘤B16细胞肺转移建模。分别给两种小鼠尾静脉注射小鼠黑色素瘤B16细胞悬液1*106个/只。C57BL/6小鼠，12d出现死亡，15 d全部死亡，肺部结节直径约0.3～3 mm，肺的颜色近乎黑。KM小鼠，22 d出现死亡，25 d全部死亡，局部瘤结节连接成线或密集成片。肺左叶上凸起直径5mm的黑色肿瘤。B16细胞株在两种小鼠均能稳定建模，KM小鼠荷瘤时间更长，颜色对于黑色素瘤的观察更有利。孟星君[9]等也选用C57BL/6品系(6～8周龄)的小鼠选用不同量B16F10细胞悬液，通过腹腔注射、尾静脉注射、皮下注射三种方式，饲养不同时间进行对照实验，尾静脉注射实验组转移率可达100%，而腹腔注射及皮下注射的实验组未发生肺转移。其中当细胞量为1*106个/只。

1.4 涎腺腺样囊性癌

涎腺腺样囊性癌是发生于涎腺的一种非常常见的恶性肿瘤,其重要特质是嗜神经侵袭。关晓峰[10]等用Balb/c裸鼠(雄性，3周龄)建立人涎腺腺样囊性癌肺转移模型。将人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞悬液1*106个/只尾静脉注入裸鼠体内，接种后3周内，肿瘤细胞夹破血管，在肺间质内形成微小转移瘤。接种后4 周肉眼可见转移灶。肉眼见转移灶呈灰白色，半球状。可位于肺膜下，亦可位于肺实质内。

由于操作方便、肺转移率高(85%～100%)，近几年基于尾静脉注射法建模，肿瘤肺转移的防治方法的相关研究有了许多新突破。

2 皮下注射法

皮下注射法即将肿瘤细胞悬液注入小鼠背部皮下或腋下，临床上多用于肝素钠皮下注射抗凝。此法虽操作方便简单，但原位癌成瘤率低，故造模限制较多。

2.1 乳腺癌

在建造乳腺癌肺转移模型时，以皮下注射法建立自发性转移模型。Balb/c裸鼠于左前肢腋下接种1.5*106个人乳腺癌MDA-MB-231细胞，8w后，肺部的转移灶在488nm激发光波长下呈现绿色，说明造模成功[5]。

2.2 黑色素瘤

选用C57BL/6品系(6～8周龄)的小鼠，通过皮下注射进行黑色素瘤肺转移建模实验时，注入大量(3*106个/只)小鼠黑色素瘤B16F10细胞悬液，肺转移率仍为0[9]。

2.3 肝癌

对于肝癌肺转移模型，Ogawa[7]等有一些新的发现。他们分离出的N1、L2、C2、C6、C1、C5F，6种小鼠肝癌细胞大量(5*106个/只)皮下注射法建模与尾静脉注射法建模相比，各个细胞的肺转移率及肺转移灶数目都有了变化。首先，C1细胞(肺转移率67%，肺转移灶17.5±27.7个/cm2)、C5F细胞(肺转移率89%，肺转移灶46.1±56.5个/cm2)通过皮下注射法都成功建模，并且有不低的肺转移率。其次，N1细胞(肺转移率64%，肺转移灶4.2±5.9个/cm2)、L2细胞(肺转移率20%，肺转移灶1.0±2.3个/cm2)肺转移率明显降低。最后，对比尾静脉注射法，C2细胞(肺转移率33%，肺转移灶0.5±0.9个/cm2)肺转移率有所下降，但C6细胞(肺转移率50%，肺转移灶1.4±2.2个/cm2)提高。

2.4 鼻咽癌

鼻咽癌是一种非常常见的恶性肿瘤，其发病快、病程短，研究其肺转移模型也有一定的意义。选用BALB/c-nu 裸鼠(雌性，4～6周龄)，皮下注射人鼻咽癌SUNE-1细胞2*106个/只，成瘤时间约10天，瘤重约2.2g，肺转移率70%，每只肺转移灶约45个[13]。

3 原位注射法

原位注射法即将肿瘤细胞悬液注入小鼠原发部位。例如将小鼠麻醉后，切开右侧胸壁皮肤1cm，暴露第2对乳腺脂肪垫, 向其中注入细胞悬液[16]。此法虽操作困难，但由于肿瘤细胞能从原发癌灶侵入血循环到达肺组织，故许多研究选择此法进行肿瘤肺转移模型建模。

3.1 肾癌

肾癌无明显临床症状，多数患者就诊时已发生肿瘤远处转移，肺为最常见转移部位。Balb/c裸鼠(4～5周龄)为常选择的建模动物。曾四平[17]等在裸鼠麻醉后，右侧腰背部纵切口, 裸露右侧肾包膜及肾脏, 将人肾癌SN12-PM6细胞悬液1*106个/只，种入裸鼠右肾实质。5周后肺转移率50%，7周转移率达到100%，但肺大体形态未见明显改变，显微镜下可见肺部为转移灶，与肾脏移植瘤细胞形态一致。将人肾癌RCC-949细胞悬液1*106个/只，注入裸鼠左侧肾包膜内，成瘤率40%，肺脏无转移[18]。

3.2 骨肉瘤

骨肉瘤为死亡率和致残率很高的原发性恶性骨肿瘤，初期症状不明显，但晚期多会发生扩散转移。建立具有人类骨肉瘤特性的动物模型，是研究和防治其的基础。骨肉瘤肺转移模型多采用后肢胫骨结节处穿刺至骨髓腔注射细胞悬液的方法。选用SD大鼠(3周龄)骨髓腔注射大鼠骨肉瘤UMR106细胞2*106个/只。转移率100%，成瘤时间约10d，瘤灶多呈栗粒样遍布双肺，小而密集[19]。姜珍[20]将人骨肉瘤MG63(1.5*106个/只)、HOS(2*106个/只)细胞悬液骨髓腔注入BALB/c-nu/nu 裸鼠(3～5周龄)。MG63细胞6周原位成瘤率为 100%，且肺转移率100%。HOS细胞组未出现原位瘤及肺转移。

3.3 结直肠癌

近年来,随着我国居民饮食结构及饮食习惯改变 ,我国结直肠癌的发病率和病死率均呈上升趋势。结直肠癌患者中10%～15%会出现肺转移。选用BALB/c裸鼠(5周龄)，建造结直肠癌肺转移模型。裸鼠被麻醉后，从右下腹开腹，使盲肠完全暴露于腹腔外，将2*106个/只人结直肠癌HCT116-luc细胞注入盲肠壁的黏膜与基层间，30d后，成瘤率58.33%，肺转移率65.71%[21]。

3.4 乳腺癌

乳垫注射是乳腺癌肺转移模型建模时常选择的建模方法。将人乳腺癌MDA-MB-435s细胞悬液2*105个/只，注射入SCID小鼠(雌性，16～20周龄)右侧第二对脂肪垫内。17周后小鼠存活率约为50%，转移率100%，每只小鼠约有1～3个肺转移灶, 直径1～2mm[16]。Paschall[22]等选用Balb/c小鼠造模，他们同样选择给小鼠一侧乳垫注射少量小鼠乳腺癌4T1-lu细胞悬液(1*104个/只)，30 d后，肺转移率达100%。他们还提出一种准确计算肺结节的方法：将荷瘤小鼠的肺用印度墨水填充膨胀，固定在费克特溶液中，肺上的白点即为转移结节。

3.5 肝癌

异种移植肝癌转移模型，即人肝癌种植于动物体内，观察人肝癌在动物体内发生、发展及转移的过程。我国建立了较多的人肝癌裸鼠模型，Tian J[23]等选用BALB/c-nu-nu裸鼠，肝内接种人肝癌MHCC97细胞悬液>1*106个/只，接种35d后肺转移率100%。Ogawa[7]等给 KSN裸鼠(雌性，8～10周龄)肝脏注射1*106个/只六种小鼠肝癌细胞悬液后(N1、L2、C2、C6、C1、C5F)，自然死亡或5周处死后，只有C6细胞(肺转移率50%，肺转移灶1.2±1.7个/cm2)和C5F细胞(肺转移率25%，肺转移灶8.5±11.9个/cm2)造模成功。

原位注射法能很好的模拟人癌症的转移过程，故较多研究选择此法建模。Suoyuan Li[24]等用Balb/c裸鼠骨髓腔内注射细胞悬液，建立骨肉瘤肺转移模型，研究纳米凝胶(STP-NG)增强紫草素(SHK)的细胞内传递，用于发挥抗肺转移的作用。研究发现STP-NG/SHK能有效抑制肿瘤生长，降低肺转移。Hong Zhang[25]等在乳垫注射细胞悬液，以Balb/c小鼠建模，研究发现奇异变形杆菌可以有效抑制体内自发性乳腺癌肺转移，并且其安全性也同时得到验证。但此法也有操作困难、成瘤率及转移率低、周期长等缺点限制其应用。

4 组织原位移植法

应用组织原位移植法建造肺转移模型，即取肺部转移瘤结节，按常规制成2mm3小块，移植于同系小鼠原发部位。与原位注射法相比，组织移植法成瘤时间更短，成瘤率更高，肺转移率更高。

4.1 乳腺癌

孙慧[26]等建立乳腺癌肺转移模型，取TA2小鼠自发肺部转移瘤结节，制成2mm3小块，移植于同系(8周龄)小鼠左侧下腹乳腺区域，每只2块。移植成活率100%，潜伏期平均4.78±0.49d，小鼠平均存活约57.71±13.83d，自发肺转移率约55.84%

4.2 肝癌

Quan Rao[27]等选择C57BL/6野生型小鼠(6～8w龄)及Balb/c裸鼠(6～8w龄)，分别建模进行比较。其取下皮下瘤后，从肿瘤中取出组织，切成1mm3碎片，植入小鼠肝左叶。C57BL6小鼠植入3～7周，局部生长、局部浸润和肝脏自发转移更加明显，肺转移率25%。裸鼠成瘤率88%，未发生肺转移。这提示不同遗传背景的受体小鼠可能会影响肿瘤的形成。

4.3 肾癌

张玉侠[18]等对比了用原位注射法及组织移植法建立肾癌肺转移模型。他们选取生长旺盛的皮下瘤组织, 剪成直径约0.5 mm3的瘤块, 将适量肿瘤组织移植于Balb/c裸鼠(4～5w龄)的肾包膜下。此法成瘤率为75%，肺转移率为53.3%不论成瘤率还是转移率，均高于原位注射法。

4.4 前列腺癌

外科原位移植技术建立的前列腺癌模型, 可以较好地保留了肿瘤细胞的生物学习性。王元天[28]等建立人类前列腺癌裸鼠原位肿瘤模型，其选择Balb/c裸鼠(4～6w龄，雄性)，下腹切口，牵开膀胱和精囊, 剪开前列腺背侧叶1 mm，将PC-3肿瘤组织块放入被膜下。9～12w，该模型成瘤率90%，肺转移率22.2%。肺转移的大体标本可见肺内散在的肿瘤结节, 镜下可见小的癌巢。

此法建立模型原位癌成瘤率高，对周围组织破坏强，但肺转移率不高，且建模部位受限。故运用此法时多有改良。Chen Y L[29]等采用生物胶糊技术原位移植构建人胃癌转移裸鼠模型。用胃癌SGC-7901细胞，构建移植的胃癌组织块，用OB生物胶贴在BALB/C裸鼠胃壁上。将此创新方法与传统胃囊法进行比较。此法原位移植成功率(100%)及肺转移率(62.5%)更高。有效证实了此法更容易建立胃癌转移模型，代表了临床转移过程。

5 PDX

PDX模型是一种将肿瘤患者的肿瘤组织移植至免疫缺陷型小鼠体内，并使肿瘤组织在小鼠体内生长而构建成的一种肿瘤模型。其建模方法为将10-20 mm3的患者来源的肿瘤组织碎块移植到免疫缺陷小鼠皮下或体内肿瘤原发部位，大多选择NOD-SCID小鼠构建模型。PDX模型建模时间相对较长(2～16个月)，且原代移植成功率较低。但其移植的肿瘤组织并没有经过任何人工培养,所以其生物学特性保持的更加完整,从而与临床相似度更高,是现阶段最理想的肿瘤动物模型。

肖凯[30]等构建了一种肺癌PDX标准化模型库。其步骤大致如下：(1)将中国患者新鲜肿瘤组着标本分为三个部分(a.快速液氮冷冻，用于提取DNA/RNA；b.福尔马林固定，石蜡包埋，用于病理学检查；c.无菌条件下切成10～20mm3肿瘤组织块，通过套管针皮下植入到免疫缺陷小鼠)；(2)使用生长因子辅助免疫缺陷小鼠肿瘤细胞增长，待肿瘤长至一定体积(500～1500 mm3)，对移植肿瘤进行体内传代；(3)肿瘤组织病理学鉴定；(4)基因分子遗传学鉴定。该法肿瘤体积与移植时间呈正比，第45d平均约为1000mm3。

为了预测肺癌有效的肝素化治疗，Amit Katz[31]等构建非小细胞肺癌(腺癌及鳞癌)PDX模型。手术样本(3h内)切割为2～3mm小片，经皮下植入小鼠侧腹。触诊当肿瘤直径达到1～1.5cm，切除肿瘤，切割为2～3mm小片，重新植入二代小鼠皮下。10～20d后肿瘤可触及。其中，建模成功率鳞癌(85%)显著高于腺癌(37%)。

Fichtner[32]等研究发现，在靶向治疗中，患者源性非小细胞肺癌异种移植模型可以作为预测性分层生物标志物。其肿瘤组织标本来源于非小细胞癌患者(鳞癌、腺癌及多表型癌)。手术肿瘤标本切成3-4mm的碎片，根据患者性别选择小鼠，在30分钟内移植于NOD-SCID小鼠皮下。观察小鼠生长情况，当肿瘤体积达到1cm3时切除肿瘤，传代至裸鼠。总移植率25%，其中腺癌占24%，鳞癌占48%，其余为多表型癌。此研究建立了广泛的病人源性非小细胞肺癌异种移植物模型，为临床前新药测试提供了适当模型。

对于肺癌患者来说，最初化疗方案的选择至关重要。为了给患者提供有效的个性化治疗，现需要可靠及可快速反应的模型工具。Xin Dong[33]等建立了患者源性第一代非小细胞肺癌异种移植模型。将新鲜肿瘤组织切成1*3*3 mm3小块，肾包膜移植于NOD-SCID小鼠(6～8周龄)，28d后分组用药，8周后评估药物作用，发现不同药物应答率有差别，总体移植成功率为90%。此模型适用于快速评估(6-8周)患者癌症的药物化学敏感性，有望应用于非小细胞肺癌患者的个性化化疗。

6 结语与展望

肿瘤肺转移模型是进行肿瘤科学研究的重要手段和平台，根据肿瘤本身特点和实验需求选择合适的建模方法，对肿瘤肺转移的发生特点、转移机制、诊断及治疗的研究具有十分重要的意义。对于肿瘤转移的研究以及抗转移治疗，可将模型建造与其他技术手段结合起来，为其研究创建更好的平台。例如运用活体成像技术来监测肿瘤的生长和转移。Masaki[34]等应用荧光素酶标记癌细胞，实时在体外及非手术条件下监测癌细胞的生长，弥补了传统试验方法的不足。基因的检测和筛选是研究转移癌的机制必不可少的手段。Shi Zhongju[35]等分析骨肉瘤原发性肿瘤和肺转移瘤中的高通量基因表达获得了差异表达基因。建立蛋白质相互作用网络，分析鉴定出2493个差异表达基因及骨肉瘤转移十大核心基因，核心基因对下一步验证骨肉瘤肺转移相关通路有重要意义。