RNA甲基化在中枢神经系统作用中的研究进展

邓宇，杜先超

（中国医科大学公共卫生学院环境卫生学教研室，辽宁 沈阳110122）

近年来，在DNA和蛋白质修饰基础上，表观转录组学（epitranscriptomics），又称“RNA表观遗传学”，成为近期的研究热点。表观遗传是在DNA序列保持不变的情况下调节基因的表达，最终导致可遗传的基因表达水平的改变，对维持染色体结构的稳定性起着重要作用［1］。表观遗传包括组蛋白共价修饰（covalent histone modification）、DNA甲 基 化 修 饰（DNA methylation）、RNA甲 基化修饰（RNA methylation）、基因组印记（genomic imprinting）、基因沉默（gene silencing）、RNA编辑（RNA editing）及非编码RNA（noncoding RNA）等，这些在胚胎和成体神经发生中起着至关重要的作用［2］。RNA作为中心法则的关键中间环节，是遗传物质DNA和蛋白质在生命活动中的纽带，而细胞内的RNA存在100多种不同的化学修饰，最常见的是N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A），此外还有5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）、1-甲基腺嘌呤（1-methyladenosine，m1A）、5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，hm5C）、假尿嘧啶（ψ）等，这些修饰在细胞内行使不同的生物学功能［3-4］。可逆RNA甲基化修饰研究引领了第3次表观遗传修饰研究的浪潮。研究发现RNA甲基化修饰在中枢神经系统发育过程中发挥了重要作用［5］。本文将从RNA甲基化调节神经元、胶质细胞、神经干细胞（NSCs）和突触的发育等几个方面展开论述。

1 RNA甲基化的概述

早在20世纪70年代RNA甲基化就已经被发现［6］，其广泛分布于mRNA、tRNA、rRNA、snRNA以及snoRNA［7］。这种修饰主要在后转录阶段发生于氮原子和氧原子上，与DNA甲基化类似，利用S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供的甲基供体，在各种甲基化酶的催化作用下完成修饰的全过程［8］。其中最具代表性的两种修饰是m6A和m5C，研究这两种修饰在中枢神经系统发育中的作用至关重要。随着酶学技术的发展，m6A的修饰酶相继被发现，其中WT1相关蛋白（WT1 associated protein，WTAP）、甲 基 转 移 酶 样 蛋 白3（methyltransferase like 3，METTL3）、甲基转移酶样蛋白14（methyltransferase like 14，METTL14）和KIAA1429等4种蛋白复合物作为甲基转移酶催化m6A的形成；而肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶AlkB同源蛋白5（AlkB homolog 5，ALKBH5）可使m6A去甲基化；m6A修饰的生物学功能可能主要通过包含有YTH结构域的结合蛋白来发挥，包括YTH结构域包含蛋白1（YTH domain-containing protein 1，YTHDC1）、YTH结构域包含蛋白2（YTH domain-containing protein 2，YTHDC2）、YTH结构域家庭蛋白1/2/3（YTH domain-containing family protein 1/2/3，YTHDF1/2/3）［9］。m5C修饰主要在mRNA和tRNA中存在，目前已发现3种甲基转移酶：NSUN2、NSUN4和Dnmt2，然而尚无去甲基化酶的发现［10-11］。相对于DNA甲基化，RNA甲基化更加复杂、种类更加繁多，并且参与调节许多生物学过程，这就决定了RNA的转录后修饰功能的多样化。研究RNA甲基化修饰在正常生理状态下对神经活动和大脑功能的调控有助于更好地理解其在中枢神经系统中的作用。

2 RNA甲基化在中枢神经系统发育中的作用

神经发生是从NSCs的神经元命运特征开始的。为了正常运行，新神经元必须整合到适当的神经网络中，并与其他神经元建立正确的通信［12-13］。化学修饰的动态过程是神经系统功能的典型特征，表观转录组之一的RNA甲基化在成熟神经元的形成、NSCs分化及自我更新过程中发挥重要作用［14］。类似于DNA和蛋白质的化学修饰，RNA修饰对细胞的功能意义是巨大的。

2.1 RNA甲基化修饰m6A在中枢神经系统发育中的作用

2.1.1 m6A去甲基化酶在中枢神经系统发育中的作用 m6A修饰在神经系统的发育及功能的行使中发挥不可替代的调控作用［15-17］。脑区是中枢神经系统必不可少的部分，而小脑是在出生后2周发育［18］，在这个过程中整个转录组范围的m6A甲基化分析描绘了脑的空间特异性甲基化谱，并揭示m6A在小鼠小脑中的甲基化水平高于大脑皮层［19］，表明m6A在该脑区域中的关键作用。m6A甲基转移酶和去甲基化酶的分子特征对于我们理解中枢神经系统中的m6A特征是必不可少的，m6A去甲基化酶FTO在大脑皮层的表达量最多，并在成熟的NSCs和神经元高表达［14］；有研究证明FTO的缺失导致成人神经发生和认知能力受损［20］。FTO在大脑中的高度表达，表明它可能通过改变调节神经相关基因功能表达的m6A RNA甲基化而在神经系统中发挥作用。m6A甲基化与去甲基化的动态过程贯穿于小鼠小脑出生后发育的整个过程，且在低压低氧环境下AL K B H5基因缺失造成参与小脑发育调控进程基因的m6A水平紊乱，加快了RNA出核过程，从而导致小脑发育明显滞后，同时，AL K B H5基因缺失通过扰乱不同细胞命运决定基因中RNA m6A甲基化的平衡而导致小脑中异常细胞增殖和分化来影响正常的小脑发育［21］。也有研究发现ALKBH5通过改变m6A水平调控了小鼠小脑中特定类型RNA的出核而影响了小脑发育［22］。目前关于去甲基化酶在中枢神经系统作用中的研究仅局限于部分脑区，没有在其他脑区进行研究论证，不排除这两种酶在其他脑区的表达变化会影响脑部发育，希望后续研究可以填补这一空白，并为神经发育在表观转录方面提供新的视角。

2.1.2 m6A甲基化酶在中枢神经系统发育中的作用 已有研究表明，常规敲除小鼠中的M ET T L3基因可导致早期的胚胎致死［23］。为了探究m6A甲基化修饰对中枢神经系统发育的影响，研究者对发育中小鼠脑中M E TTL3基因进行条件性敲除，在皮质和小脑区域均引起严重的发育缺陷，进一步研究发现，M ET T L3基因敲除的小鼠表现出小脑发育不全，其原因是外部颗粒层（EGL）中新生小脑颗粒细胞（CGC）的细胞凋亡急剧增加；METTL3失活诱导的m6A修饰缺失导致RNA半衰期的延长和异常的mRNA剪接，从而导致了不适当的细胞分化和细胞死亡，并且使转录组基因表达失调和CGC过早死亡；这表明METTL3介导的m6A转录后水平在哺乳动物小脑发育中起着关键调节作用［24-25］。同时，在小鼠的中枢神经系统中敲除M ET T L14基因也会严重影响小鼠大脑皮质的发育［26］。据此，RNA甲基化修饰m6A在中枢神经系统发育过程中发挥的作用不容忽视。

2.1.3 m6A识别蛋白在中枢神经系统发育中的作用 神经突向外生长是神经元发育和成熟、突触形成、神经功能和疾病功能恢复的关键，对神经突分支和YTHDF2-/-神经元延伸的严重影响也可能导致神经发育过程中神经发生缺陷［27］。RNA甲基化修饰m6A的结合蛋白YTHDF2也参与中枢神经系统发育的调节作用。Li等［28］研究发现，m6A结合蛋白YTHDF2通过促进神经发育相关mRNA靶标的m6A依赖性降解来调节神经发育。有研究发现，m6A甲基转移酶METTL14或m6A结合蛋白YTHDF1通过调节损伤诱导的蛋白质翻译来调节外周神经系统的功能性轴突再生［26］。随着研究的深入，有研究发现了m6A甲基化在哺乳动物皮质神经发生的时间进程和调节成年哺乳动物神经系统轴突再生中的作用［17，26］。综上所述可见，RNA甲基化修饰m6A在中枢神经系统发育的过程中发挥着关键作用。

2.2 RNA甲基化修饰m5C在中枢神经系统发育中的作用 RNA甲基化修饰m5C在中枢神经系统发育中的作用研究虽然没有m6A的研究广泛，但也有研究报道m5C的甲基转移酶NSUN2也参与神经发育的调节。在人类中，抑制NSUN2的表达可以抑制神经迁移，并且在血管生成素存在下会干扰人类NSCs的神经分化进而损害神经谱系，因此，m5C RNA甲基化途径是对神经谱系诱导刺激的有效细胞反应所必需的［29］。Blanco等［30］研究报道了小鼠和人类N SU N2基因的功能丧失均会导致包括小头畸形，以及认知和运动功能缺陷的生长迟缓和神经发育缺陷。为了解NSUN2及其甲基化RNA靶标如何干扰神经分化途径，在前脑发育的所有RNA中鉴定了所有NSUN2依赖性m5C［31］，证明甲基转移酶NSUN2在甲基化修饰过程中参与中枢神经的发育调节。但尚未见其他m5C的甲基转移酶对中枢神经系统的发育有调节作用，在这一方面还需进一步的研究和论证。由于RNA甲基化修饰m5C的局限性和其研究的特殊性，对其在中枢神经系统发育过程的调节作用还有待进一步研究证实，纵观表观转录组学在中枢神经系统功能研究，不难得出m5C修饰的作用也不可小觑，相信在以后的研究中还会有新的发现。

3 RNA甲基化在神经细胞发育过程中的作用

NSCs是具有自我更新功能的多能细胞，是中枢神经系统的主要部分，其生态位位于侧脑室下区基部的内皮细胞以及海马齿状回颗粒下区［32］，而发育中的CGC祖细胞在EGL中增殖，然后通过分子层迁移至内部颗粒层以分化成颗粒细胞，产生平行纤维并与浦肯野细胞形成突触连接［18，33］。而在整个神经系统发育过程中NSCs的维持和分化受到错综复杂的表观转录分子网络调控，揭示这些机制对于了解成人大脑的功能和可塑性至关重要。

3.1 RNA甲基化修饰m6A在神经细胞发育过程中的作用 RNA甲基化修饰m6A在神经元功能和生理学中的功能特征仍处于初期阶段，在哺乳动物神经系统中，m6A调节已经在几种生理功能中得到证实，包括神经发育和突触可塑性，以及成瘾、神经损伤和应激反应等［14，34-35］，由此可见，m6A修饰在神经细胞的发育过程有着复杂的调节作用。

3.1.1 m6A去甲基化酶在神经细胞发育过程中的作用 Li等［16］研究结果表明FTO在神经细胞发育中起着重要作用，FTO的丢失降低了成人神经干细胞（adult neural stem cells，aNSCs）的分化，确定了FTO在神经细胞分化中的作用。脑源性神经 营 养 因 子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）是提高神经元存活和可塑性的重要调控因子，在神经元发育中起重要作用，FTO调节BDNF的表达并且发现BDNF信号传导途径的几种组分的m6A修饰标记的转录物［36-40］，说明RNA去甲基化酶FTO参与神经元的调控。同时也有研究表明FTO的缺乏可以减少aNSCs的增殖和神经元的分化，从而导致学习记忆的受损，说明通过FTO调节m6A的修饰而改变基因表达进而在神经发生以及学习记忆中起重要作用［34］。目前尚未发现其他去甲基化酶在中枢神经细胞发育过程的调控作用。

3.1.2 m6A甲基化酶在神经细胞发育过程中的作用 有研究发现，m6A甲基转移酶也参与调节神经元、NSCs的发育。在小鼠胚胎中，通过敲除NSCs中METT L14的表达而使m6A缺失，可导致细胞周期进展延长和分化延迟，从而将皮质神经发生延伸到出生后阶段，尽管它们在NSCs中早期表达，m6A似乎也负责抑制神经元谱系基因（Neuro g2、Neurod 1、Neurod2）［41］。此外，敲除胚胎小鼠脑中ME TT L14基因致使m6A的缺失，从而延长了放射状胶质细胞的细胞周期，并将皮质神经发生延伸到出生后阶段，同时敲低M ET TL3基因致使m6A减少也可导致细胞周期延长和放射状神经胶质细胞的分化［26］。METTL14缺失导致体内胚胎小鼠皮质和培养的皮质神经祖细胞（NPC）中mRNA的m6A水平显著降低，通过有条件地灭活胚胎NSCs中的METTL14，发现METTL14是NSCs增殖所必需的并且维持NSCs处于未分化状态，这些结果表明m6A mRNA甲基化在调节小鼠和人的皮质NPC细胞周期进程中起保守作用［26］。通过调节mRNA衰变，外源转录m6A标记为动态基因表达的时间控制提供了关键机制，其反过来调节小鼠和人的皮质NSCs的细胞周期进程。同时还证实了，m6A通过调节组蛋白修饰物的mRNA稳定性改变组蛋白修饰，改变组蛋白修饰异常抑制增殖相关基因并激活分化相关基因，导致NSCs基态丧失。总之，通过促进与转录因子、NSCs、细胞周期和神经元分化相关的转录物的mRNA衰变，确定了m6A表位转录机制在哺乳动物皮质神经发生的时间控制中的关键和保守作用［26］。

3.1.3 m6A识别蛋白YTHDF2在神经细胞发育过程中的作用 YTHDF2缺失对皮质发生、神经发生和胶质细胞生成具有严重影响；YTHDF2通过调节与神经发育和分化相关的m6A标记基因的RNA降解，在胚胎神经发育过程中发挥关键功能。Li等［28］研究发现，NSCs自我更新和神经元和其他细胞类型的时空生成受胚胎新皮质中YTHDF2缺失的影响，YTHDF2敲除的小鼠NSCs的增殖和分化显著降低；神经元不能产生正常的神经突，不能分化为神经胶质细胞；神经元分化相关的m6A修饰的mRNA延迟降解，导致延迟的皮质神经发生。

3.2 RNA甲基化修饰m5C在神经细胞发育过程中的作用 RNA甲基化m5C修饰的甲基转移酶NSUN2也发挥着神经细胞发育调节的作用。在发育中的小鼠脑中，NSUN2的缺失不会影响放射状胶质细胞，但会延迟分化为上层神经元，NSUN2在早期神经外胚层细胞中表达，其能够分化成各种区域特异性神经元和神经胶质细胞类型［42-43］。总之，NSUN2的缺失通过减少皮质板中分化的上层神经元的数量而损害正常的大脑发育。RNA甲基化修饰m5C的研究没有m6A修饰研究广泛，仅有少量的文献证明m5C参与中枢神经细胞发育的调节。

4 RNA甲基化调节突触的形成参与学习记忆

虽然RNA甲基化修饰的种类繁多，广泛的研究仅集中在m6A和m5C两种修饰，但是关于RNA甲基化调节突触的形成参与学习记忆方面仅有m6A修饰发挥作用的研究，而尚未发现其他甲基化修饰在该过程中的调节作用。体外细胞实验和体内实验证明神经元中的FTO蛋白可以在细胞核、细胞体和树突（包括突触）之间穿梭，并且能够导致局部RNA甲基化动力学改变［19-20］。甲基化转录物高度偏向于神经元基因和功能，例如突触功能；m6A的转录组谱在不同的脑区被空间调节。在单个神经元的水平上，m6A修饰的RNA及其相互作用组扩散到特定结构，如轴突、树突、突触前神经末梢和树突棘。这种空间分布支持m6A的功能库控制突触传递和可塑性。m6A-表型转录组中的动态变化以依赖于经验的方式为m6A功能在形成中枢神经系统的转录组学中提供了基础。哺乳动物脑中m6A的转录组学分析揭示了m6A对神经元的特定偏向，而不是神经胶质细胞基因，m6A-seq分析在整个小鼠脑、中脑、皮质和小脑中的功能分类已经鉴定出m6A靶基因，其中大多数参与神经系统发育、突触传递和突触后功能。这些基因具有不同的细胞作用，特别是在转录调节、RNA代谢和细胞内信号级联中的作用显著［34，44-45］。突触体mRNA的m6A-seq分析表明，m6A主要在远端突触前和突触后区室中分布［46］，大多数m6A靶基因参与功能性表达包括“突触”和“细胞连接”，以及表面受体途径等；所有这些基因都维持三联突触的完整性和功能性，包括突触前和突触后终端，以及它们与星形胶质细胞的相互作用［15］。还有研究报道了m6A在轴突中的定位及其在轴突生长中的作用，编码轴突延伸因子GAP-43的转录物被鉴定为mRNA靶标，是轴突生长中起重要作用的m6A修饰转录物之一，其局部翻译被m6A负调节并且可以通过轴突中的FTO调节［15，47］，可见RNA甲基化修饰在神经突触的发育及功能中也发挥着重要作用。FMRP是神经元局部翻译的重要调节因子，可与含有m6A的mRNA体内结合，FMRP因其在代谢型谷氨酸受体（mGluRs）依赖性信号传导和突触可塑性中的作用而被充分研究［48］。FMRP和YTHDF1在m6A修饰的mRNA子集上的竞争性结合可能影响转录物的翻译速率进而影响突触可塑性［49］。也有研究发现在正常生理条件下，FMRP通过维持和调节关键突触蛋白（包括CaMKII、PSD95和谷氨酸受体亚基）的翻译在突触可塑性中起重要作用，也通过阻止核糖体延长或通过其与miRNA和RNA诱导的沉默复合物的相互作用反馈调节树突mRNA子集的翻译［50-51］。

抑制FTO导致小鼠背根神经节神经元中m6A增加也导致轴突长度变短，这表明平衡的m6A标记对于最佳轴突生长非常重要［16］。有研究发现，F TO基因敲除小鼠在空间学习中表现出障碍，证明了m6A可能在记忆巩固过程中微调转录组学反应，并且观察到可塑性相关转录本的m6A标记普遍增加［35］。虽然许多研究表明DNA修饰（DNA甲基化、组蛋白修饰）在记忆形成中发挥重要作用，但RNA修饰的贡献仍然很大程度上未被探索。有研究证实了FTO在细胞体内以及在突触脊附近的存在，表达模式也与FTO在突触可塑性和记忆形成中重要的观点一致，同时还发现了FTO存在于突触附近，突触细胞膜成分中FTO的优先减少暗示了突触中甲基化mRNA增加对于记忆形成的重要性；并且提供直接证据表明在训练前（使用两种独立方法）在兴奋性CA1神经元中特异性地去除FTO足以增强情感恐惧记忆［35］。总之，这些发现表明FTO，特别是在突触附近，通常可以限制记忆形成。此外，这些结果清楚地表明mRNA甲基化是神经可塑性的关键调节剂。解释FTO如何影响记忆形成的最简单模型是FTO抑制突触的前记忆转录物，可能通过抑制树突状定位mRNA的翻译［35，45］。在突触核区与核区室中区分FTO靶标的单个基因或位点对于释放记忆形成中mRNA甲基化的特定功能至关重要。最近一项研究表明脑内神经元中甲基转移酶METTL3或去甲基化酶FTO的缺失改变了m6A/m表观转录组，增加了恐惧记忆，并改变了对恐惧和突触可塑性的转录组反应［52］。也有研究者通过敲除小鼠内侧前额叶皮层（mPFC）中的m6A去甲基化酶FTO，使其增加总m6A水平，导致恐惧记忆的强化巩固，并证明了m6A在成年大脑中以活动依赖性方式受到调节，并且可能在记忆相关过程中微调mRNA转换［53］。以上的研究表明RNA甲基化修饰过程在神经突触的发生以及功能调节作用显著，进而在学习记忆过程中的调节也扮演着重要角色，同时通过对其调节机制进一步研究，为后续神经系统疾病以及学习记忆障碍等的防治提供理论基础和科学依据。

综上所述，随着RNA表观转录组学研究的深入，尤其对RNA甲基化修饰的研究开始兼顾与疾病关联性，因此研究RNA甲基化在神经系统发育中的作用和机制有利于理解相关疾病的发生机制，对神经退行性疾病的预防与治疗会有很大的帮助。同时随着研究的进展，RNA甲基化在中枢神经系统发育中的作用将会被人类所阐明。目前，大量的研究都集中在m6A的RNA甲基化修饰在中枢神经系统发育中的作用，而m5C的RNA甲基化修饰等其他的修饰在中枢神经系统发育中的作用研究的还比较局限，在调节机制上还没有明确的研究报道，还需要进一步研究去揭示出新的调节机制。相信未来新兴技术的发展将会有效推动RNA甲基化修饰在中枢神经系统发育中的调节作用，为后续中枢神经系统疾病的预防和治疗提供更好的解决手段。