帕金森病抑郁动物模型的研究进展

李 颖, 王 晴, 徐瑾业, 丁冬怡, 李 含,朱俪安, 袁玉刚, 王小洪

(扬州大学医学院, 江苏 扬州, 225001)

帕金森病(PD)是一种常见的神经退行性疾病，其主要症状是静止性震颤、运动迟缓、步态失调、肌肉强直等运动功能障碍。抑郁是帕金森病最常见的非运动症状，临床症状表现为认知功能减退、兴趣缺失、快感下降等。抑郁在帕金森病患者的发病率达到50%～70%, 不仅影响患者的生存和生活质量，更加重了帕金森病患者的运动功能障碍。目前多数动物实验集中在PD模型的机制与治疗，而帕金森病抑郁(PDD)的动物模型的研究尚少。本研究对目前存在的PDD动物模型的建立方法、发病机制及评估方法等研究综述如下。

1 PDD的发病机制

1.1 神经递质异常学说

目前越来越多的研究表明神经递质在PDD的发生、发展中起重要作用。多种假说被普遍认可，如去甲肾上腺素学说、5-羟色胺(5-HT)学说等。

1.1.1 多巴胺: 帕金森病患者脑内主要的病理改变就是多巴胺(DA)能神经元的大量选择性丧失[1], PDD患者脑内DA水平显著低于正常人，针对DA受体的治疗能明显改善帕金森病患者的抑郁状态。DA在情绪活动中有重要的调控作用，推测DA在PDD的发生、发展中可能起着至关重要的作用。本实验室使用1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶(MPTP)和慢性轻或中度应激共同暴露的方法成功建立帕金森病伴发抑郁的小鼠模型，结果显示MPTP注射后应激暴露组的小鼠脑内DA水平较正常组及PD组小鼠均显著下降，且下降程度具有应激程度的依赖性。

1.1.2 γ-氨基丁酸(GABA): GABA是一种重要的抑制性神经递质，主要存在于中脑黑质区。GABA的水平异常及GABA受体功能障碍与癫痫、阿尔兹海默症、抑郁症等神经精神疾病的发生、发展有关。研究[2]发现PDD患者血浆GABA水平显著高于正常人，可见GABA水平异常与PDD的发生、发展有着密不可分的关系。此外，各型GABA受体、GABA与其他神经递质(谷氨酸、DA等)的相互作用也在PDD的发生、发展中起重要的作用。本实验室用MPTP腹腔注射和慢性轻或中度应激共同暴露的方法建立PDD小鼠模型，PCR法检测各组小鼠前额叶内GABA受体的表达量，结果显示PDD小鼠脑内GABA水平显著升高，而海马区无明显改变。

1.1.3 去甲肾上腺素(NE): NE属于儿茶酚胺类神经递质, NE功能低下学说是抑郁发病的机制之一。黑质区多巴胺能神经元系统与基底节及其他部位的神经递质存在一定的关联，严重的多巴胺能神经元缺失导致去甲肾上腺素系统功能的障碍。已有学者[3]就神经递质的协同与拮抗作用在PDD的发展中的作用展开研究, NE能神经元功能障碍导致去甲肾上腺素及5-HT分泌减少，从而导致抑郁的发生。

1.2 5-HT系统功能异常学说

1.2.1 5-HT系统在PDD发展中的作用: 5-HT系统功能障碍是抑郁发生、发展的重要因素之一。研究表明, PD患者脑脊液中5-HT的代谢产物5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)水平明显高于健康人，而Mayeux 等[4]研究发现PD伴重度抑郁的患者脑脊液中5-HIAA 水平显著高于PD无抑郁症状的患者。PD尸检和MPTP诱导的PD猴模型病理学[5]检测发现，二者皮质区和皮质下基底核区5-HT和5-HIAA的水平也显著下降，且PD患者尾状核内5-HT和5-HIAA水平的下降与抑郁症状密切相关。PD中黑质-纹状体通路的DA系统损伤会导致5-HT系统功能障碍，两种系统可能存在复杂的相互作用关系。Zhang等[6]研究则发现，在不同亚型的MPTP PD小鼠模型中，其脑内的5-HT水平及行为学表现存在显著的差异: MPTP急性PD小鼠存在显著的5-HT水平降低，旷场实验中表现为行走路程显著降低等抑郁行为; 亚急性模型小鼠则出现较正常小鼠显著的行为活跃的现象，有学者认为这是多巴胺能神经元严重损伤导致的5-HT系统严重障碍而出现的一过性代偿表现，但具体的发生机制有待进一步深入研究。另外，给6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的PD模型大鼠腹腔注射左旋多巴(L-Dopa)后，大鼠前额叶、杏仁体、海马等脑区5-HT的水平显著升高[7]。以上动物模型数据表明, DA和5-HT两种神经递质系统在PDD发生、发展的过程中存在一定的相互作用。

1.2.2 PDD中5-羟色胺受体功能的改变: 5-HT从神经末梢释放后与5-羟色胺受体结合发挥特定的生物学效应，目前已经确定7种5-羟色胺受体(5-HT1-7R), 每种包含多种亚型。每个脑区表达的亚型种类不同，其发挥的生物学作用也不一致。一项11C-DASB PET头部扫描结果发现，小部分PDD患者背外侧和前额叶皮质的5-羟色胺受体结合率升高，且PDD患者的扣带回、中缝核尾端也出现5-羟色胺受体结合率升高的现象。Zhang等[8]研究发现，小鼠腹腔注射MPTP 7 d后，有抑郁症状的小鼠脑内5-HT2B受体水平显著下降，而无抑郁症状的PD小鼠无明显改变。本实验室利用腹腔注射MPTP结合慢性轻或中度应激刺激的方法建立PDD小鼠模型，结果显示PDD小鼠脑内5-HT水平较正常组小鼠显著下降，且MPTP注射结合慢性中度应激暴露的小鼠脑内5-HT水平下降最为明显。PDD小鼠前额叶5-羟色胺5a受体(5-HT5aR)、5-羟色胺5b受体(5-HT5bR)、5-羟色胺6受体(5-HT6R)水平显著降低，而海马区各5-HT受体水平则无明显改变。

1.2.3 PDD中5-羟色胺系统功能障的脑区: ① 中缝核区: 中缝核区5-HT能神经元损伤在帕金森病的进展中发挥重要作用。中缝核尾侧区的5-HT能神经元与帕金森病中疼痛、胃肠功能紊乱等非运动性症状有密切关系。研究[9]发现，帕金森病重度抑郁患者经颅超声检查中发现中缝核区低密度阴影，且低回声区面积大小与患者的抑郁程度呈正比。PDD患者的磁共振检查发现脑干中缝核区的匀质性较无抑郁症的PD患者显著下降，乃是PDD患者该脑区中大量神经元变性死亡所致[10]。Prinz等[11]研究发现, 6-OHDA大鼠模型中背侧和脑干中缝核区的5-HT能神经元激活增加，而PD大鼠对5-HT受体激动剂的反应性降低。上述研究表明，中缝核区的5-HT系统功能障碍参与了PDD的发生与发展。② 丘脑底核区: 丘脑底核分为感觉运动区、联络区和边缘区3个功能区，边缘区域通过与丘脑、杏仁核和蓝斑等结构联系参与调控抑郁行为。丘脑底核接受来自中缝背核的5-HT能纤维支配，主要表达5-HT1A、5-HT1B、5-HT2C和5-HT4受体亚型。膜片钳研究[12]结果发现, 5-HT可激活5-HT2C和5-HT4 受体而增加神经元放电频率, 5-HT1A受体激活则降低放电频率。Beyeler等[13]证实注射5-HT2C受体激动剂后，大鼠内侧丘脑底核等边缘区域的Fos表达增加，其他区域无明显改变。高频电刺激丘脑底核治疗帕金森病患者运动症状的同时，产生抑郁的行为学改变。

1.3 神经炎症

炎症是PD重要的病因，参与了帕金森病的进展过程。大量临床和实验学数据[14]表明, PD患者和动物模型脑内出现小胶质细胞激活，炎症介质如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)等的水平显著升高。PD小鼠模型体内的周围性炎症使其血脑屏障通透性增加，进而加剧脑内一系列免疫炎性反应，使DA、5-HT及NE能神经元变性死亡[14]。同时，持续的脑内炎症反应对神经元功能及神经元再生起负调节作用，参与PDD的病理、生理过程[14]。长期腹腔注射LPS制作模拟PD炎症的小鼠模型，悬尾实验和强迫游泳等行为学结果显示这种PD小鼠模型中存在显著的抑郁症状[15]。长期给予小鼠炎症介质IL-1后，小鼠脑内脑源性神经营养因子(BDNF)的基因和蛋白水平都显著下降，表明炎症介质能加速神经元的损伤[15]。脑内海马齿状回和脑室下区存在神经元发生的情况能缓解PDD的抑郁症状。脑内炎症反应产生的炎症介质可以通过激活转录因子如糖皮质激素受体从而使成年患者海马区域的神经发生降低，加剧PDD的症状。

2 帕金森病抑郁的动物模型

PD动物模型大部分同时伴有抑郁症状，可被筛选为PDD模型。另外，研究者们在经典的PD动物模型中施加一定的不可预见性刺激因素，可诱导出模拟PD患者的抑郁症状。

2.1 MPTP诱导的PDD模型

研究[16]发现，大鼠连续腹腔注射MPTP 12～18 d后发生了液体消耗总量降低、消耗蔗糖减弱、体质量减轻、强迫游泳实验静止时间增加等症状，证明MPTP可诱导大鼠产生抑郁症状。Marta G等[17]以鼠尾悬浮和蔗糖偏爱等实验检测MPTP诱导的急性PD小鼠的行为学表现，未发现小鼠产生抑郁症状。研究[16]表明，66.7%的亚急性PD啮齿类动物模型存在抑郁症状。小鼠连续腹腔注射5周MPTP建立慢性PD小鼠模型，并发现该种慢性PD小鼠具有稳定的抑郁症状[18]。MPTP诱导的PD模型动物中出现的抑郁症状较轻且不稳定，不易出现病理特征。

慢性不可预见性应激(CUMS)是通过随机给予实验动物倾斜动物笼、潮湿垫料、强光照射、冰水游泳等10余种慢性刺激来建立抑郁动物模型。近年来，许多实验使用神经毒素和CUMS共同暴露的方法建立抑郁动物模型。Udaiyappan等[14]发现，与CUMS或MPTP单独暴露的小鼠相比, CUMS和MPTP共同暴露的方法构建的PDD模型抑郁症状更显著, 5-HT降低更明显，氧化应激和炎症反应更为严重，黑质纹状体区中BDNF水平均显著下降。同时，此研究在共同暴露组中，还设计了MPTP暴露前应激、MPTP暴露后应激以及MPTP暴露前后均应激3组。与MPTP暴露前应激和暴露前后均应激组相比, MPTP应激后CUMS暴露组小鼠表现出的运动量减少最显著，炎症反应和氧化应激相关蛋白水平降低均最显著，这表明MPTP暴露后CUMS应激能产生显著且稳定的抑郁状态。神经毒素和CUMS共同暴露建立的PDD动物模型抑郁症状显著，但其症状较临床PDD患者的症状较重，且病死率高。

2.2 6-OHDA诱导的PDD模型

Santiago等[19]发现, 6-OHDA除可产生帕金森病行为学特征以外，还可产生抑郁症状; 同时，其还发现6-OHDA大鼠模型的抑郁行为并不稳定，表现为术后14 d蔗糖偏好增强，而抑郁症状在第21天后才明显地表现出来。

目前，常在大鼠脑部立体注射6-OHDA建立PD模型后给予CUMS诱导产生抑郁症状。邢红霞等[20]利用大鼠脑内注射6-OHDA制作PD模型后，给予急性应激和CUMS制作不同类型的PDD模型，发现PD大鼠合并急、慢性应激后均表现出抑郁症状，尤其是PD大鼠合并CUMS的抑郁症状最为显著。由此可见，大鼠脑部立体注射6-OHDA结合CUMS可诱导出稳定的帕金森病抑郁症状，但此模型是单侧急性损伤的模型，不能准确模拟临床PDD患者的病理和症状。

2.3 PD转基因模型

转基因模型主要是基于家族性PD相关基因的发现，目前已经鉴定16个致病基因, PD转基因动物模型基于以上基因。常用的a-synuclien过表达的PD模型小鼠未观察到抑郁样行为学改变。一项研究发现，一种Parkin基因外显子缺失的PD转基因小鼠行为学实验中未发现抑郁样行为。Taylor等[21]发现VMAT2基因突变的PD转基因老龄鼠(12～15月龄)在强迫游泳和悬尾实验中表现为不动时间显著增加的症状，而年轻VMAT2基因突变小鼠(4～6月龄)中未发现任何抑郁样行为学改变。

3 PDD动物模型的评价的方法

3.1 行为学评价

3.1.1 糖水偏爱实验: 糖水偏爱实验能反映动物是否存在快感缺失。糖水偏爱度为蔗糖水消耗量占水消耗量与蔗糖水消耗量之和的比值，本实验主要检测PDD动物快感缺失的症状。

3.1.2 旷场实验: 旷场实验是评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为的方法。检测指标包括动物总探索距离、穿越箱子底面方格的数量和双前肢抬起的次数。本实验方法主要用于检测PDD动物运动减少的抑郁症状和运动功能。

3.1.3 Morris水迷宫实验: 该实验能检测动物的空间学习能力和再认知能力，主要方法包括定位航行试验与空间探索试验。本方法主要检测PDD动物的记忆和学习能力。

3.1.4 悬尾实验: 行为绝望是抑郁样行为的表现之一，悬尾实验通过使动物无法克服不正常体位的手段诱导产生行为绝望。

3.2 分子影像学技术

影像学技术的飞速发展为评价抑郁动物模型提供了更直观、准确的生物学指标，如海马体积、脑内糖代谢水平等。

3.2.1 磁共振成像技术: 高强场磁共振技术在神经结构方面有着良好的显示能力。包和华等[22]发现，用磁共振成像技术测得抑郁症大鼠双侧海马体积显著小于对照组，与传统检测手段(如糖水消耗实验)的结果相比具有更显著的相关性。朱彦等[23]利用磁共振质子波谱技术测定抑郁大鼠模型海马区代谢情况，发现抑郁大鼠模型左侧海马区Glx/Gr、NAA/Cr值对比正常组显著下降，且与脑脊液内IL-2、IL-6水平呈显著负相关。

3.2.2 正电子发射体层成像技术: PET-CT中发展出一种专门检测小型啮齿动物脑内代谢的影像学技术，即小动物PET(micro-PET)。氟[18F]标记的脱氧葡萄糖-小动物PET脑功能成像(18FDG-micro-PET)能通过脑内葡萄糖代谢间接反映其功能代谢的变化。朱长强等[24]采用18FDG-micro-PET技术研究大鼠脑内的葡萄糖代谢，发现抑郁大鼠模型丘脑、海马、纹状体内葡萄糖代谢水平显著下降。

3.2.3 光遗传学: 光遗传技术是通过基因工程的手段，将光感基因转入神经元中进行离子通道的表达。离子通道在不同波长和频率的光照刺激下选择性允许某些阳离子或阴离子通过，使细胞膜两边的电位发生改变，从而选择性地兴奋或抑制神经元。利用光遗传学可以帮助揭示参与PDD发生、发展的神经环路，如刺激中脑腹侧被盖区中的多巴胺能神经元后，小鼠的抑郁相关行为改善，证明该脑区的神经元与抑郁发病相关。光遗传技术的出现大大优化了动物行为学的实验设计[25], 如高架迷宫实验配合光遗传学操控也可进行自身对照试验(有光或无光)，极大的缩短了实验周期和动物用量。由于光遗传技术具有时间精确性，使得动物行为学实验中研究关键时间窗脑区功能成为可能。例如，实验动物在T迷宫里做出左右方向选择的时间点。因成本低、周期短等特点，光遗传技术在啮齿类动物模型中应用广泛。光遗传技术为今后PDD方面的研究提供了更敏感精确的研究方法。

3.3 脑透明技术

Clarity 技术最早于2013年在Nature上报道。它是一种全新的脑组织形态学分析技术，该技术能保证大脑中每一个神经元、蛋白质、脱氧核糖核酸链以及化学信号物质都被锁定在原来的位置，因此能轻松地检测出被标记分子，从而显现出原有组织细胞形态的三维立体图像[26]。Clarity技术应用于PDD的研究有利于追踪发病过程中不同脑区神经递质表达变化的情况，探讨参与PDD发病的神经环路机制，筛选在PDD发生、发展中起重要作用的关键蛋白。另外, Clarity技术与功能磁共振成像技术相结合可揭示PDD发生发展过程中神经网络连接的变化。

4 小 结

抑郁在PD患者中发病较高，可能是神经递质异常、神经炎症、心理社会因素等多种元素相互作用的结果。要彻底揭开PDD发生发展的过程及机制，必须建立模拟人类PDD病程及演变规律的动物模型。目前建立的PDD动物模型不仅数量少，且实验动物模型与PDD患者之间存在巨大的差异。理想的PDD动物模型要具有以下特征: ① 可检测到PD的运动功能缺陷及随时间进展的演变规律; ② 可检测到显著的抑郁症状; ③ 能模拟临床PDD的病理生理学进展过程; ④ 能模拟PDD患者脑内的神经递质变化规律。