高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法测定富硒酵母中硒

2019-02-11杨萍

质量安全与检验检测 2019年6期

关键词：中硒残渣提取液

杨萍

（盘锦检验检测中心辽宁盘锦 124010）

1 前言

硒是一种重要的微量元素，具有抗氧化、提升免疫力、抗重金属等多种功效。本文中采取超声破碎硒胞壁之后，利用酶解法提取含硒产品。利用高效液相色谱电感耦合等离子体质谱法进行检测，可以分析提取液中硒的存在方式，并用于酵母品质的分析评估。

2 研究材料和方法

2.1 材料和仪器条件

材料：高效液相色谱仪（waters 600）；电感耦合等离子体质谱仪（赛默飞x7）；超声破碎（fs300）；硒代尿素，硒标准储备液浓度为100 mg/L，具体为称取亚硒酸钠，硒酸钠等利用水进行溶解，同时加入硝酸，以2∶98的比例作为溶剂，将其稀释至相应的浓度。

仪器条件：高效液相色谱条件为选取色谱柱，其型号为water ssym，metryshIelDRpI.Rp18的保护柱，柱温条件为室温，进样量为100 μL，流动相选取甲醇水溶液，其流量为1 mL/min，梯度洗脱程序为0～5 min为甲醇-水溶液，6～25min 为甲醇-水溶液，26～30 min为甲醇-水溶液。以聚醚醚酮（PEek）管进行色谱柱与电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）仪的连接，以保留时间进行定性，峰面积进行定量。

ICP-MS的设置条件为：射频功率1 200 W，采样的深度为12 mm，时间为20 ms，联用时为100 ms，碰撞时测定模式冷却器，挤压器流量为13 L/min，辅助器的流量为0.8 L/min，碰撞器为氢气和氦气的混合气体，流速为7.5 L/min。

2.2 测定同位素硒

在具体使用方法中，首先需要准确称取0.4 g富硒酵母产品，加入pH为7.5的硒盐酸缓冲液中，经冰浴之后超声提取，严格控制超声功率240W，每隔10s超声1次，破碎超声30 min后，将所得破碎液加入链霉蛋白酶中，混合物在37℃之下以100 r/min的速度搅拌18 h之后[1]，离心30 min，将所得酶解提取及提取残渣用于酶含量的测定和酶存在形式分析。

分析和测定硒含量，硒形态。准确称取0.05 g富硒酵母、0.2 mL的酶提取液及0.1 g提取残渣，加入硝酸、过氧化氢混合之后，置于室温过夜，在170℃条件下进行密闭消化8 h，将其置于80℃下，旋转蒸发至0.5 mL，利用硝酸溶液定容至1 mL，在ICP-MS条件下消化处理富硒酵母提取液[2]，用于残渣中硒含量的测定，利用超滤膜过滤酶提取液的大分子后，在2.1仪器运行基础上进行硒存在形式含量的测定。

3 研究结果

3.1 提取液和残渣中硒含量

通过研究发现，经超声0.5 h破碎之后，提取液中的蛋白量比较稳定且不会升高[3，4]，为排除蛋白酶溶解的影响，可以将提取液分离后分别加入4 mL缓冲液于残渣中，分4次进行0.5h超声，在第2次超声过程中所提取的总蛋白量为上一次的20%。本文所选取的样品提取液用量在超声0.5 h后需要继续超声，此时蛋白质容量有一定程度的上升，这可能是由于硒细胞未完全破碎导致的。由于考虑超声波的时间较短，能够有效防止提取液中含硒分子转化，因此，本文选取0.5 h作为超声破碎的时间，在超声时需要将冰样品置于冰上，防止在超声过程中出现分子转化，超声破碎后在蛋白酶水解下能够水解细胞壁，将蛋白质水解释放肽链，结合的富硒分子进行解离之后，酶提取液和残渣中硒含量详见表1。由表1可知，提取率达80.97%，除由于细胞没有完全破碎导致分析存在误差外，硒没有被全部提取出来，主要是以多糖形式存在于细胞壁中和提取残渣中，在酶解的过程中加入搅拌可显著提高硒的提取率。虽然通过酶解法能够破坏样品中的蛋白质，但其通过膳食结构进入人体之后，蛋白质会通过水解形成氨基酸，再次被人体吸收。因此，通过酶解法进行新产品提取是比较合理的技术。

表1 富硒酵母的酶解提取液以及残渣中含有的硒成分

3.2 绘制标准曲线

可以选择不同浓度的含硒标准储备液，将其配置为对应的系列溶液，以硒浓度为横坐标（μg/L），以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，在2.1仪器运行基础上进行测定。结果详见表2。

表2 线性回归方程

3.3 样品分析

选取呼吸样品，按照上述方法进行测定，根据硒化合物标准曲线计算酶解提取液硒含量和破碎液中的硒含量（表3），通过研究发现上述6种含硒化合物的酶解提取液中，硒含量占据酵母总硒量的70.01%，65.26%的硒是以硫代甲硫氨酸（SeMet）存在，因此，在本研究中，该富硒酵母产品中大多数为有机硒，并且大多数是以SeMet形式存在的，能够为人体吸收。