西青果等对多重耐药嗜麦芽窄食单胞菌的抑菌活性

左惠芬 赵 菲 王军花 谷敬欣 吕国平 吴淑慧*

（1.河北以岭医院检验科 河北石家庄 050091；2.河北工程大学生命科学与食品工程学院；3.河北中医学院基础医学院)

1 前言

众所周知，嗜麦芽窄食单胞菌是一种条件致病菌，同时也是导致人类高发病率、高死亡率的重要医院感染病原菌，有严重基础疾病、高龄、重症、免疫力低下、长期使用广谱抗菌药物的患者易感，该菌除了对碳青酶烯类抗菌药物天然耐药外，对其他抗菌药物耐药性也极高，往往呈现多重耐药性。近年来，嗜麦芽窄食单胞菌引发的感染备受关注，临床上该菌的治疗非常棘手[1]。而中药抗感染治疗有悠久的历史，清热解毒类中药在抑菌方面表现出巨大的优势和开发价值[2-6]。基于以上背景，本文用西青果、黄连、黄芩、板蓝根、龙胆5种中药对嗜麦芽窄食单胞菌的抑菌活性进行检测，以期寻找对嗜麦芽窄食单胞菌有效的中药，为有效控制该菌感染提供新方法。

2 材料与方法

2.1 菌株的选取

实验菌株由河北以岭医院和河北医科大学第三医院临床患者的痰液、尿液、脓液、血液、脑脊液、腹水等标本进行分离收集，经筛选，得到12株对复方新诺明等14种抗菌药物全耐药的嗜麦芽窄食单胞菌，经API 20NE鉴定条进行鉴定。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853和嗜麦芽窄食单胞菌ATCC17666（康泰生物科技有限公司）。

2.2 试剂

Mueller-Hinton琼脂（杭州天和微生物试剂有限公司）；API 20NE鉴定条（法国生物梅里埃公司）；哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/棒酸、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、复方新诺明药敏纸片（康泰生物科技有限公司）；西青果、黄连、黄芩、龙胆、板蓝根（河北以岭医院药房）。

2.3 试验方法

2.3.1 中药水煎液的制备

将所选5种中药采用常规方法制成水煎液[7]，即100 g中药制成200 mL 50%中药水煎液。高压蒸汽灭菌115℃ 30 min，4℃冷藏备用。

2.3.2 含药Mueller-Hinton（MH）平板制备

将50%（1∶2）中药水煎液用无菌蒸馏水倍比稀释9个梯度，置于试管中，1～9号试管含药液浓度依次为 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512，各10mL；10号管为10mL蒸馏水，作为无药对照液。

称取MH粉末38 g，加蒸馏水900 mL加热溶解后，经121℃ 15 min灭菌；采用无菌操作的方法，分装10瓶，每瓶90 mL。

将上述倍比稀释的中药稀释液及无药对照液分别加入相应MH培养基中，充分混匀后倾注于4个内径为90 mm的平皿内，待凝固后备用。最终获得的培养平皿药液浓度分别为：1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560、1∶5 120、0， 备用。

2.3.3 含药MH培养基的药物浓度计算

将50%原药材水煎液100 mL置于干燥箱中烘干，称重，计算出1 mL水煎液的中药干重及含药培养基中的中药干重，如每100 mL 50%西青果煎液干重为16 920mg，第1组每100mL含药培养基中含煎液10 mL，则每毫升培养基含煎液干重为：

第1组含药培养基的含煎液干重为16.920mg/mL，根据倍比稀释法，从1∶20至1∶5 120各稀释度的培养基内药物浓度分别为：16.920 mg/mL、8.460 mg/mL、4.230 mg/mL、2.115 mg/mL、1.058 mg/mL、0.529 mg/mL、0.265mg/mL、0.133mg/mL、0.067mg/mL。

2.3.4 中药试验相关指标测定

将嗜麦芽窄食单胞菌的新鲜菌落混悬于3 mL生理盐水中，调整浓度至0.5麦氏单位，10倍稀释后备用。用微量加样器吸取1 μL菌液接种至备好的不同含药平皿上，按含药浓度从低到高的平皿顺序接种，最终接种菌量为104CFU，35℃培养20～24 h后观察，如果无药平板上菌株全部生长，则记录最低抑菌浓度（MIC），统计各中药的MIC50（抑制50%细菌生长的最低药物浓度）、MIC90（抑制90%细菌生长的最低药物浓度）[8]。

2.3.5 纸片（KB）法药敏实验

参照相关标准，采用KB法做常规药敏试验，测量抑菌环直径，其中左氧氟沙星和复方新诺明依据CLSI 2018版嗜麦芽窄食单胞菌的药敏试验标准判读[9]，其余药物因CLSI暂无针对嗜麦芽窄食单胞菌的标准，故头孢噻肟、头孢曲松参照不动杆菌属，其余10种药物参照铜绿假单胞菌的标准判读，报告结果敏感（S）、中介（I）、耐药（R）。

3 结果

（1）12株嗜麦芽窄食单胞菌对哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/棒酸、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、复方新诺明14种抗菌药物全部耐药。

（2）西青果等5种中药在不同浓度下对嗜麦芽窄食单胞菌ATCC17666的抑菌情况详见表1，其中西青果、黄连、黄芩的水煎液对标准菌株有不同程度的抑制作用，板蓝根、龙胆的水煎液则无抑制作用。

（3）西青果等5种中药对12株嗜麦芽窄食单胞菌抑菌活性情况详见表2，检测的5种中药中西青果、黄连、黄芩的水煎液对嗜麦芽窄食单胞菌有不同程度的抑菌活性；板蓝根、龙胆的水煎液在此次实验中即使在最高的浓度下对嗜麦芽窄食单胞菌仍无抑菌活性。

（4）西青果、黄连、黄芩的水煎液对嗜麦芽窄食单胞菌质控菌株和临床菌株的MIC、MIC50、MIC90详见表3，无论质控菌株抑或临床菌株，西青果抑菌活性最强，黄连、黄芩次之。

表1 嗜麦芽窄食单胞菌 ATCC17666在不同浓度中药平板上的生长情况

表2 不同浓度中药对12株嗜麦芽窄食单胞菌累积抑菌百分率

表3 中药对12株嗜麦芽窄食单胞菌的抗菌活性

4 讨论

近年来，嗜麦芽窄食单胞菌引发的感染有所增加，该菌对β-内酰胺类、碳青霉烯类、头孢菌素类、氨基糖苷类、大环内酯类等多数抗菌药物广泛耐药，其耐药机制主要与抗菌药物灭活酶、细菌外膜通透性降低、mqnrs基因以及整合子、多药外排泵系统、生物被膜形成等相关[10]，可供临床选择的药物有限，因此，人们应该重视该菌引发的感染，一方面，根据药敏报告结果合理选择抗菌药物；另一方面，采取适当的院内感染干预措施，减少该菌的播散，积极地寻找可替代药物已刻不容缓。

中药抗菌作用历史悠久，中外研究者对此做了许多研究工作并取得了可喜的成果。中药含有多种抗菌成分，可同时作用于细菌不同部位、生长阶段与代谢环节乃至于人体的免疫系统。区别于已有抗菌药物的单一成分的作用，具有独特的优势。本文试验中西青果、黄连、黄芩无论对嗜麦芽窄食单胞菌标准菌株和全耐药的临床菌株均有良好抑菌效果，尤其西青果最低抑菌浓度小，黄连、黄芩次之。

西青果，亦称藏青果，是使君子科植物诃子的干燥幼果，在藏族，西青果被视为圣药，具有解毒疗伤、清热生津等多种作用。西青果富含酚酸类化合物，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等多种药理作用[11]。关于西青果体外抑菌活性的研究报道较少，林小静等[12]报道西青果对铜绿假单胞菌质控菌株和耐药菌株均有较强的抑菌作用，在本次试验中检测到其抑制嗜麦芽窄食单胞菌质控菌株和临床菌株的效果最好。王奉悦等[13]报道西青果总鞣质与没食子酸乙酯对金黄色葡萄球菌的杀菌机制与改变细菌细胞膜形态结构相关，而西青果对嗜麦芽窄食单胞菌的抑菌成分、机制尚待进一步研究。西青果作为抗菌药物的开发，仍值得进一步关注。

本次试验中黄连、黄芩对嗜麦芽窄食单胞菌的抑菌效果也较好。陈仁德等[14-16]研究证实黄连、黄芩对临床常见病原菌、耐药菌均有不同程度的抑制作用。黄连不仅对普通细菌有很好的抑菌作用。王丽等[17]报道黄连对申克孢子丝菌也有很好的抑菌作用。李奕铮等[18]报道黄连水煎剂不仅能抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成，而且与苯唑西林钠联合可提高金黄色葡萄球菌导致的腹膜炎疗效。黄连能否与抗菌药物联合更好地治疗由嗜麦芽窄食单胞菌引起的感染值得探索。黄芩的主要成分是黄酮类化合物，主要有黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等，其中黄芩的抗菌有效成分以黄芩苷为主。刘连等[19]报道黄芩苷和黄芩素对变形链球菌具有很好的拮抗生物膜效果。刘彦晶[20]等报道黄芩对NDM-1乙酸钙不动杆菌有抑菌及质粒消除作用，关于黄连、黄芩对于嗜麦芽窄食单胞菌的抑菌成分及作用机理有待进一步研究。