应用血清PIVKA-II诊断肝细胞癌研究进展*

邢 昊，韩 骏 综述，杨 田 审校

原发性肝癌（PLC）可大致分为肝细胞癌（HCC）和肝内胆管细胞癌（CC），两者分别起源于肝细胞或者肝内胆管上皮细胞。作为最常见的恶性肿瘤之一，PLC死亡率高居全球肿瘤死亡率第二位。而在全球范围来看，近50%的PLC新发及死亡病例发生在中国[1]。据2015年中国癌症统计数据显示，原发性肝癌在中国癌症相关死亡率的排例中位列第四位，发病例数约为46.61万例[2]。有调查显示，中国癌症患者的5年相对生存率约为30.9%，而肝癌患者仅为10.1%，在所有种类的恶性肿瘤中，肝癌预后最差[3]。究其原因是因为大多数肝癌患者在临床确诊时已处于晚期，失去了接受根治性治疗的机会。因此，早期诊断能够大大延长PLC患者的存活时间。甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）是目前临床上应用最广泛的肝癌诊断肿瘤标志物；但另一方面，因其敏感度、特异度较差，所以对PLC的早期诊断价值有限[4]。最新美国肝病研究学会（AASLD）、欧洲肝病学会（EASL）的临床推荐指南[5，6]，已经将肝癌血清标志物，如AFP、AFP-L3和维生素K缺乏或拮抗剂II诱导的蛋白（protein induced by vitamin K absence or antagonist（IIPIVKA-II）的定期检测去除，而将超声检查作为肝癌高危人群唯一的筛查及监测手段。然而，超声检查的诊断能力有较大的局限性，依赖于操作者个人操作水平以及超声设备，单一的超声检查很难完全满足临床对于肝癌监测及诊断的需求。日本等发达国家已将PIVKA-II应用于HCC（多由丙型肝炎病毒感染引起）常规筛查和早期诊断，有报道指出其诊断HCC的特异性为84%，敏感性为72%[7]。PIVKA-II作为近年来研究较多的一种HCC肿瘤标志物，并且与HCC的发生密切相关，本文就PIVKA-II在HCC中的应用进行综述。

Liebman最早于1984年报道了将PIVKA-II作为PLC的血清学标志物[8]。近年来其在肝癌诊断中逐渐成为研究热点。在生理条件中，凝血酶原前体在肝细胞内经γ-谷氨酰羧化酶的作用下，其上的谷氨酸残基羧化为γ-羧基谷氨酸，转化为正常的凝血酶原。而PIVKA-II的特点是其结构中一个或多个谷氨酸残基不完全羧化为γ-羧基谷氨酸，因此PIVKA-II是一种失去了正常凝血酶原功能的异常凝血酶原。而γ-谷氨酰羧化酶的作用需要维生素K的辅助，因此在维生素K缺乏和服用华法林的人群可检测出PIVKA-II[9，10]。

1 PIVKA-II的生物学功能

目前已有的大量临床研究证实：PIVKA-II可作为肝癌的筛查以及预后判断指标。然而PIVKA-II在肝癌组织中过表达、以及肿瘤增殖为何与PIVKA-II的过表达有关，其机制目前尚未完全阐明，已有的基础研究结果有助于研究者更好地理解PIVKA-II在肝癌发生及发展中所发挥的作用。

2.1 PIVKA-II对肝癌细胞的增殖作用 PIVKA-II的结构中包含两个环形结构域，该结构域与肝细胞生长因子相似[11]。在肝细胞生长因子（HGF）中，环形结构域有助于HGF与受体（Met）的稳定结合，从而诱导细胞增殖。PIVKA-II促进细胞尤其是肝癌细胞增殖的机制可能是其与Met结合，激活下游通路，从而诱导增殖。Suzuki et al研究发现，在添加了纯化PIVKA-II的肝癌细胞系中，DNA合成水平明显提高。且这种现象在无PIVKA-II生成的细胞系中更为明显，这些结果均提示了PIVKA-II可诱导肝癌细胞的增生。更进一步的研究显示，PIVKA-II与Met结合之后，激活Met-Janus激酶-信号转导及转录活化因子-3通路，诱导HCC细胞增殖[12]。以上结果均提示了PIVKA-II促增殖的作用机制可能与HGF相似。研究者通过改变PIVKA-II的分泌量进而分析PIVKA-II对肝癌细胞增殖的影响，注射维生素K2，显著降低了在肝癌细胞系中PIVKA-II的表达量，从而评估PIVKA-II的降低对肝癌细胞系的改变。实验数据显示，PIVKA-II表达的下降降低了肝癌细胞系的恶性程度，维生素K2以剂量依赖方式抑制了HCC细胞系的生长。分析发现在裸鼠的体内注射维生素K2可显著降低肿瘤异体移植后的重量以及血清PIVKA-II水平，同时未观察到明显的急性或迟发毒性作用。该研究结果显示通过控制PIVKA-II的水平或许可以抑制癌症进展，证明了PIVKA-II与肿瘤的生物学行为存在着联系[13]。

2.2 PIVKA-II对肝癌细胞的成血管作用 PIVKA-II可提高肝癌组织周围的成血管作用，这是PIVKA-II在肝癌中的另一个生物学效应。Fujikawa利用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）分析PIVKA-II的成血管作用，结果显示PIVKA-II可促进DNA合成以及HUVEC的迁移，而正常凝血酶原无此类效应。进一步研究显示，PIVKA-II通过与激酶插入域受体（KDR）相结合，激活KDR-PLC-MAPK信号通路，继而促进DNA合成和细胞迁移[14]。其他研究也得出了类似结果。PIVKA-II诱导了EGFR和VEGF在HUVEC细胞中的过表达[15，16]。以上研究结果均提示了肝癌组织分泌的PIVKA-II可诱导肝癌周围组织的血管生成，进而影响患者的预后。高富军等人研究发现PIVKA-II可以促进肝癌细胞中多种血管生成因子的表达，包括VEGF、TGF-β、bFGF。血管生成是肿瘤发生及发展过程中不可或缺的现象，同时与较差的肿瘤行为紧密联系，高微血管密度可能导致肝癌的复发。因此，PIVKA-II在肿瘤进程中通过诱导血管生成发挥了重要作用，这些研究均有助于理解PIVKA-II是如何促进肝癌进展[17]。

2 PIVKA-II诊断HCC的价值

肝癌高危人群包括有肝肿瘤家族史、AFP持续低浓度阳性或肝功能异常的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性、有肝硬化表现等人群[18]。目前，最为常用HCC的监测方法是血清AFP和超声检查。根据HCC发生、发展的速度，指南推荐的监测周期为6个月[19]。AFP是应用最为普遍的肝癌血清标志物，然而其仍然存在以下不足：慢性肝病患者尤其是肝细胞再生活跃者，在未出现恶变情况下，血清AFP常常也会升高；对于肝癌诊断AFP的敏感度很低，据报道仅1/3的HCC患者血清AFP升高超过100 ng/ml；在小肝癌中，甲胎蛋白常表现为正常水平。

1984 年，Liebman et al报道在76例HCC患者中有69例患者体内表达高水平PIVKA-II[8]。同时他们发现在28例慢性活动性肝炎病人中，仅3例病人PIVKA-II水平升高。目前，40 mAU/ml是PIVKA-II最为常用的临界值，在这一临界值下，小肝癌的早期诊断率得以提高[20]。AFP和PIVKA-II的形成机制互不相同，两者之间无相关性。因此，将AFP以及PIVKA-II联合应用可提高对HCC的检出率和准确性[21]。PIVKA-II诊断的特异性优于AFP，仅5%的非恶性肝病病人会出现超过100 ng/ml的PIVKA-II水平升高。而在肿瘤直径较大的HCC，PIVKA-II的表达水平与肿瘤大小相关，有研究报道在小于3cm的HCC患者中，仅20%患者PIVKA-II水平出现升高[22]。根据Nakamura et al的报道，PIVKA-II在小肝癌中的诊断能力（即敏感度和特异度）低于AFP，在较大的肝癌诊断中情况则相反，PIVKA-II的诊断能力要高于AFP[23]。在Baek et al研究中评价了PIVKA-II水平与HCC分期的相关性。该研究表明，PIVKA-II在检测大于5cm，3-5cm和小于3cm的HCC患者中，阳性率均高于AFP（分别为96，83，74%vs 65，57，48%）[24]。高春芳等报道了 PIVKA-II在以乙型肝炎相关性HCC为主中国人群中的应用价值，研究结果显示PIVKA-II以临界值40 mAu/ml检测肝癌，诊断敏感度和特异度分别为82.6%和89.1%，均高于AFP（敏感度：67.8%，特异度91.2%），且PIVKA-II的受试者工作曲线下面积显著高于AFP。PIVKA-II在诊断早期HCC以及AFP表达阴性的HCC中也显示出优势，而PIVKA-II数值与肿瘤包膜、肿瘤大小和数目以及TNM肿瘤分期等肿瘤进展参数显著相关[25]。综上所述，PIVKA-II在肝癌的诊断包括早期诊断中具有独特的优势，诊断能力显著优于临床上最常用的诊断指标AFP。同时PIVKA-II能够更好的反应肿瘤的进展程度，进一步支持了其作为HCC诊断标志物的临床价值。

3 PIVKA-II在判断HCC患者预后的价值

对于HCC患者来说，理想的术后结果为患者实现长期的生存同时无HCC的复发。然而，绝大多数患者在确诊的时候已处于晚期，这类患者的治疗往往效果较差，预后不佳。Yamarnato et al对AFP和PIVKA-II在HCC诊断中的作用进行研究，对714例肝切除术患者进行回顾性队列研究。计算了这些标志物的灵敏度和特异度，评估根治性手术切除后标志物的反应变化，研究标志物水平与预后变量之间的相关性，以及手术前和复发后的标志物水平的相关性。研究结果显示AFP和PIVKA-II的ROC面积分别是0.79和0.91（P＜0.001）。术后6个月分别有184/229（80.3%）的患者和245/246（99.6%）的患者从AFP和PIVKA-II阳性转化为阴性（AFP临界值为20 ng/mL，PIVKA-II临界值为 40 mAU/mL，P＜0.0001），标志物水平之间无相关性（γ=0.23）。而PIVKA-II水平与肿瘤大小密切相关，AFP与肿瘤大小则无相关性（γ分别为0.51和0.19）。术后≤6个月复发患者的AFP和PIVKA-II水平与术前测定的水平相关（γ=0.78和0.49）；但在术后2年复发的患者中，未发现这一相关性（γ=0.31和0.30）。研究者认为，在诊断HCC时，PIVKA-II比测定AFP更为准确。尽管在肿瘤进展时，两种指标均有上升，但二者之间并未发现相关性[26]。

此外多项研究均指出，高PIVKA-II水平与HCC的侵袭性和转移性有关[27]。Pote et al研究者对85例HCC和43例肝硬化患者进行对比研究，PIVKA-II不仅在早期HCC的诊断上较AFP有优势，单因素和多因素分析结果均提示PIVKA-II水平是微血管侵犯（MVI）的独立危险因素（HR：3.5，P＜0.043），而MVI则是一项明确的HCC复发和死亡相关因素[27]。在另一项纳入218例行肝切除术病人的研究中，Shirabem报道了术前PIVKA-II水平、肿瘤直径和组织分化程度与出现MVI显著相关[28]。Shimada研究证实了上述结论，研究纳入了40例患者（受试者均接受了活体肝脏移植术），研究结果显示PIVKA-II水平＞300mAU/ml与MVI相关[29]。这些研究均提示了PIVKA-II水平高提示较差预后。在肿瘤预后评价方面，Kim do et al研究发现，血清PIVKA-II水平和肿瘤复发相关，即使在直径≤3 cm的小肝癌患者中，血清PIVKA-II水平的升高仍然发生在肿瘤组织血管浸润之前。晚期肝癌门静脉侵犯的病人，其血清PIVKA-II水平明显升高[30]。小肝癌往往预后较好，因此，理想的HCC肿瘤标志物应当在小肝癌也能够有尚佳的表现。Kim et al研究者对180例HCC患者进行回顾性研究，患者的肿瘤大小均小于2厘米，多因素分析结果显示PIVKA-II≥200 mAu/ml是肿瘤复发的独立危险因素（OR=3.619，P=0.016）[31]。综上所述，PIVKA-II是一种有预后判断价值的肿瘤标志物，不仅可以较准确地预测肿瘤进展情况，还可为评估患者的预后提供相关依据，从而指导临床医生选择个体化的治疗方式。

4 联合应用PIVKA-II与其他肿瘤标志物的临床诊断价值

到目前为止，AFP是最常用于检测HCC的肿瘤标志物，但是由于特异度、灵敏度较差，其对肝癌的早期诊断价值有限。因此寻找有效的肝癌肿瘤标志物仍然是研究人员努力的方向，通过多种HCC标志物的联合应用有望提高诊断能力[32，33]。目前已经发现了多种肿瘤标志物在HCC中会升高，包括甲胎蛋白异质体（AFP-L3）、上皮特异性细胞黏附分子（EpCAM）、异常凝血酶原（PIVKA-II）、α-L-岩藻糖苷酶（AFU）等，这些血清标志物既有自身独到的诊断价值，也存在局限性[34]。多项研究发现，血清PIVKA-II同其他肿瘤标志物联合应用对于HCC诊断以及监测治疗疗效均具有比较高的临床应用价值。Hidenori T研究173例病人原发性肝癌肝切除术手术前后体内肿瘤标志物的变化情况，3种肿瘤标志物分别为DCP、AFP、AFP-L3。研究显示，术后3种指标升高情况与病人生存率及肿瘤复发率相关，术后升高的指标数目越多，复发率相应升高，同时生存率也相应降低[35]。Young EC根据术前乙型肝炎相关性肝癌病人的DCP和AFP水平，将其分为I组（AFP＞20 ng/dL且DCP＞40 mAU/m）和II组（AFP＞20 ng/dL 且 DCP＜40 mAU/mL；AFP＜20 ng/dL 且 DCP40 mAU/mL；AFP＜20 ng/dL 且 DCP＜40 mAU/mL）, 根治性切除术后随访结果显示：I组是术后复发的显著预测指标。与II组相比，I组的无病生存率明显缩短，因此该研究者认为，DCP与AFP的联合应用可能是判断复发的预后指标[36]。Lee研究显示，在接受动脉化疗栓塞的初治肝癌病人中，AFP对治疗的反应性和PIVKA-II基线值可作为判断总生存率的预测指标[37]。有类似研究证实高PIVKA-II基线值与不良预后及高复发风险显著相关，尽管高PIVKA-II基线值是如何影响预后尚未完全明确，研究者认为部分原因是由于高基线值与肿瘤的血管侵犯、肝内转移、肿瘤大小、TNM分期、肿瘤高复发率显著相关。另有研究者对79例HCC和77例肝硬化患者血清中AFP、PIVKA-II和AFP-L3同时进行检测，结果显示：当PIVKA-II＞40 mAU/mL和AFP＞10 ng/mL 时，这种诊断标志物的组合AUC最大（0.765），AFP与PIVKA-II结合使用可以提高诊断能力，但结合AFP-L3并不能显著提高这种组合的诊断效能[38]。

5 结语与展望

综上所述，PIVKA-II在肝癌诊断及预后判断方面有着良好的临床应用前景，而PIVKA-II与AFP、AFP-L3等这些肿瘤标志物的联合检测有助于提升肝癌早期诊断效率，从而实现早期诊断、早期治疗，极大的改善预后。PIVKA-II在肝癌发生及发展的过程中所起到的确切作用，PIVKA-II的产生机制，以及PIVKA-II应用于肝癌高危人群的监测，这些均是未来研究者的研究方向。