新鲜同种异体骨软骨移植技术的研究进展

王鹏飞，姜文学（天津市第一中心医院骨科，天津 300192）

随着手术及活体组织储存技术的进步，新鲜同种异体骨软骨移植（fresh osteochondral allograft，OCA）手术受到更多的关注。在年轻的患者（50岁）中，以膝关节软骨病变多见，尤其是单灶病变，其中以创伤性关节软骨损伤多见。大量研究证明超过2 cm2的关节软骨损伤难以自我修复，如果任其发展，可能累及整个关节软骨面出现退变，从而过早地面临关节置换的风险，所以此类损伤需要通过外科手段进行修复。对年轻患者膝关节软骨病变的患病率，流行病学无准确记录。一项调查研究显示，在接受关节镜手术的患者中有60%～66%的患者存在软骨病变，其中5%～20%的损伤累及软骨全层，11%是局灶性损伤，需要进行软骨修复手术，这其中55%（占全体研究样本总数的6%）的损伤大于2 cm2［1］。而创伤后膝关节软骨病变率约为20%［2］。当前的治疗手段包括：关节镜下清理联合微骨折技术、自体软骨细胞移植技术、自体骨软骨移植（osteochondral autograft transplantation，OAT）技术及OCA技术。其中OAT及OCA技术经临床验证效果确切。OAT技术的优势为移植骨取自于自体、无免疫风险、无疾病传播风险，术后自体骨融合性好。但这是一种“拆东墙补西墙”的无奈之举，缺点同样明显，需取自体非负重区软骨，造成二次损伤，取材区域关节表面与受区不匹配，供区有限不能修复大面积软骨损伤。

OCA技术对于重建关节损伤具有较长的历史。关节损伤被供体同区域的成熟透明软骨组织所取代。早在20世纪初Erich Lexer就开始了新鲜关节软骨移植开始此技术的应用［3］。而新鲜小块的骨软骨移植治疗关节损伤始于20世纪70年代。其后手术量不断增加，有文献报道2011年美国的OCA手术量约为1 600台次，之后每年OCA手术数量不断增加［4］。手术范围不断扩大，由膝、髋关节逐步扩展到踝关节、肩关节。OCA治疗软骨损伤面积也不断扩展，由局灶性的单极损伤扩展为同一关节多灶的修复。总体术后长期随访结果为术后5年移植物存活率为95%，术后10年移植物存活率为71%，术后20年移植物存活率为66%［5］，术后关节活动度及满意度高。有文献报道对运动员膝关节软骨损伤进行OCA修复，术后多数运动员可恢复术前竞技水平［6］。Gracitelli等［7］比较了46例膝关节软骨损伤直接行OCA（A组）和46例膝关节软骨损伤行微骨折术后失败行OCA手术的患者（B组）资料，术后10年A组术后移植物存活率为87.4%，满意率为87%，B组术后移植物存活率为86%，满意率为97%，移植物存活率无统计学意义，但B组患者术后满意率更高，这可能与之前经历过失败的手术相关。尽管有些患者因术后并发症等原因需要再次行OCA手术，但其满意度仍然很高。

1 治疗原理

关节软骨结构的特殊性决定其很难使用组织工程的手段再造出成熟的软骨。首先，成熟的软骨细胞分泌软骨基质并进行细胞代谢。其次，关节软骨依靠其下层的软骨下骨与骨组织相连接，其间无明显交界，属于渐变的组织。OCA技术的原理则是供体可以同时提供成熟的软骨细胞及稳定状态的基质连带其下的软骨下骨进行移植手术，这些活的软骨细胞可以在宿主体内继续存活并分泌软骨基质，从而发挥支撑关节的功能。 软骨组织为无血管组织，依靠关节内压力使关节液弥散进行组织代谢，同时这种结构无需神经支配。OCA技术可以一次性的解决软骨、软骨下骨病变。

2 软骨组织获取及存储

对于新鲜同种异体组织的获取有严格的操作规范。1998年美国组织银行协会 （American Association of Tissue Banks collaborated，AATB）和美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）对于新鲜人体组织的获取时间、储存介质制定了标准。从经验上看，同种异体骨软骨的获取、处理、检测和储存的每一个过程都非常重要。这些流程只能在指定的中心或组织库进行，才能保证获取组织的安全性和质量。

供体的筛选过程非常严格，包括对捐赠者的病史（是否进行过关节手术）及一般社会关系（包括冶游史）进行调查。目前的指南包括人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）1/2抗体、人T淋巴细胞病毒（human T-cell lymphotropic virus，HTLV 1 / HTLV 2）抗体、乙型肝炎表面抗原和核心抗体、丙型肝炎病毒、梅毒进行血清学检测，还需对供体血液进行细菌培养检测。新鲜移植物供体的年龄标准通常在15～40岁之间。同时软骨取材时需要对关节软骨进行大体观察。尽管进行了多项血清学检测，但在手术知情同意书中仍需向患者注明有细菌或病毒传播的风险，这些风险无法具体量化。有文献报道，在既往进行的50万例的OCA手术中，极少发生疾病传播，其风险与输注人血制品引起疾病传播的风险相当。因此通过目前的筛查项目，其疾病传播的风险已经降到最低［8］。

新鲜骨软骨组织的细胞活性是保证OCA术后效果的前提，如何在保证软骨细胞活性及软骨基质质量的前提下，尽可能长时间的储存新鲜骨软骨组织是目前研究的方向之一。与细胞的冷冻保存不同，冷冻会对软骨及软骨基质造成明显的损伤，复温后细胞活性下降，软骨基质变性。这是因为高浓度的冷冻保护剂（如二甲基亚砜、乙二醇、甘油）具有细胞毒性，其次由于软骨基质的阻挡，细胞保护剂很难均匀渗透大块骨组织，同时由于关节组织体积较大，无法保证其冷冻及复温的均匀性［9］。因此，大块关节组织不能使用玻璃化冷冻技术，进行长期保存。目前常规的做法是，骨软骨组织于供体死亡24 h后取出，0℃～10℃（4℃）环境保存。但是有研究证明，在37℃无血清储存液的情况下，软骨组织在获取28 d后其表面软骨细胞存活率、上层软骨细胞存活率、中层软骨细胞的存活率分别是80%、65%、70%，这相较于4℃环境下保存有明显优势。但目前应用于实际的软骨储存的温度仍以4℃为主［10］。

供体骨软骨取材应在供体死亡24 h内进行，但由于厌氧菌的培养时间长，即便是在理想的培养基中也需要14 d的时间才能观察到，因此目前新鲜骨软骨组织一般在储存14 d时进行OCA手术。有研究证实，在4℃环境下，7 d时软骨细胞存活率良好，14 d后软骨细胞存活率下降，具有统计学意义，28 d时软骨细胞存活率约为新鲜组织的70%［11-12］。有文献报道平均由取材时间到OCA手术，平均骨软骨体外保存时间为 24（15 ～ 43）d［10］。

体外保存液同样是影响软骨细胞活性的因素。通常的做法是将获取的新鲜骨软骨组织放置于乳酸林格液中保存，直至血清学及细菌学检测确认安全的前提下才进行OCA手术。有研究也证实将新鲜骨软骨组织放置于含有胎牛血清的保存液中，28 d时与无血清保存液储存的软骨细胞活性相比有明显提高。但由于胎牛血清有动物源性疾病传播的风险，因此无法应用于临床。保存液会加入头孢唑啉（1g/L），实际应用中每7 d在无菌环境下更换保存液，同时留取替换下的保存液标本进行细菌学检测［13］。

3 免疫风险

只要涉及异体新鲜组织移植就无法回避免疫排斥反应这个问题，新鲜同种异体骨软骨组织从结构上可分为软骨层及软骨下骨质两种成分，其免疫原性是不同的。软骨是天然的免疫豁免组织。软骨组织无血管、淋巴组织，人类软骨外基质是一种高度保守的序列，软骨细胞包裹于其分泌的基质内，避免了与体内免疫系统进行接触，从而避免了细胞及体液免疫反应。如果其软骨基质的完整不受破坏则不会诱发宿主致敏［14］。软骨下骨的骨质成份确实可以引起体液的免疫应答，术后患者体内可以出现人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-Ⅰ抗体阳性。但在OCA术后翻修的病例中没有病理学上的证据证明存在明显的免疫排斥反应。进行新鲜同种异体骨软骨移植手术无需进行HLA及血型配型检查［15］。手术过程中需要对取下的软骨组织进行反复的冲洗，以尽量去除软骨下骨组织中的细胞、体液、骨髓等强免疫原性组织。Hunt等［16］将OCA术后HLA-Ⅰ抗体阳性42例与OCA术后HLA-Ⅰ抗体阴性42例对比，术后平均随访50.3个月，结果发现术后产生HLA-Ⅰ抗体与移植物大小呈相关，移植物面积越大越有可能产生HLA-Ⅰ抗体。两组患者术后膝关节功能评分及并发症发生率无明显差异。其中在OCA术后因移植物引起失败的病例中，HLA-Ⅰ阳性组与阴性组在术后时间、移植技术、移植物面积及位置方面无统计学差异。移植物的存活率与多种因素相关，如基础疾病、力线改变、移植物与关节面解剖不匹配等。Gross等［17］对OCA术后发生因严重退变而失效的病例研究中，将原有移植物取出进行病理学检查，其组织内无如淋巴细胞浸润等免疫排斥反应［18］。

4 OCA手术适应证及禁忌证

常见的手术适应证包括创伤性关节炎、剥脱性关节炎、骨坏死、髌股关节炎、ICRS评分Ⅲ和Ⅳ软骨损伤且面积＞2 cm2的患者。对于早期软骨损伤接受微骨折及软骨细胞移植失败的情况也可行OCA手术。

剥脱性关节炎（osteochondritis dissecans，OCD）：尽管自体骨软骨移植、微骨折、自体软骨细胞移植多种方式可修复OCD，但OCA已经成为治疗OCD的首选方法。不同于其他方式，OCA同时重建软骨与软骨下骨。Emmerson等［19］报道使用OCA治疗OCD巨大软骨损伤，平均年龄28.6 （15～54） 岁，术后平均随访7.7年，移植物5年存活率为91%，10及15年存活率均为75%，关节功能优秀率为72%。

创伤性关节炎：胫距关节的创伤性关节炎是棘手的骨科难题。对于创伤性踝关节炎晚期的年轻患者，OCA可以完成胫骨关节面、距骨关节双关节面结构重建。这是OCA修复踝关节独有的技术。

骨坏死：OCA技术治疗骨坏死具有理论上的优势，即通过移植物从结构上解决坏死骨病灶及关节软骨表面损伤的问题。OCA技术可用于股骨头坏死Ficat分期Ⅱ、Ⅲ的患者。为使OCA治疗骨坏死的疗效最好，治疗同时应停止使用固醇类药物，其可抑制移植物内血运重建从而再次引起关节面的愈合不良或塌陷。稳定的固定、彻底去除坏死骨以及保护性的关节负重，是OCA治疗骨坏死的关键因素。

骨关节炎：OCA对于＞50岁的晚期骨关节炎患者预后差。因骨关节炎为关节内广泛软骨损伤，伴随关节内微环境改变，OCA技术只能解决负重区部分软骨损伤问题，因此应用OCA技术修复骨关节炎仍存在争议。

OCA技术不能替代关节置换术，它只是针对有症状的年轻关节疾病分阶段治疗的一部分。下肢力线异常及关节不稳是OCA技术的禁忌证，因此OCA术前或术中需要对力线进行纠正。相对禁忌证包括多间室软骨损伤、严重骨关节炎、不明原因滑膜炎、代谢性骨关节炎（痛风）。

5 OCA手术技术及部位

OCA手术方式取决于软骨损伤的类型、大小、部位。OCA手术常用两种手术技术来治疗关节软骨损伤：Shell技术及Plug技术。Shell技术需要术中根据缺损大小，手工修剪移植的形状来保证与缺损的匹配。Plug技术是使用手术器械在供区截取一个标准大小的圆柱形，同样在宿主制备一个同样大小的缺损，使用（软骨塞）镶嵌技术，将移植物固定于缺损处。由于Plug技术可以方便的制备出标准形状的移植物，因此这种技术多使用于股骨髁、股骨滑车及髌骨的关节面修复。但是Plug技术应用前提是移植物的大小能覆盖软骨损伤，去除损伤后其周围软骨边界是良好的（Well-Shouldered损伤），软骨柱垂直方向放置于关节面。

以Plug手术为例，一般采用正中或侧方的小切口，暴露软骨损伤区域，使用标尺确定软骨损伤大小，导引器定位出缺伤中心，并打入导针，空心圆柱切割器沿导针轻轻打入，保证使用铰刀时软骨缺损边缘的整齐度，使用铰刀沿导针钻入，制备出底部平坦的标准圆柱形缺损。通常深度10 mm（6～12 mm），若需要使用多个移植物固定时，在缺损组织之间建议保留1～3 mm的正常组织。术中在缺损区分别标记并测量12、3、6、9点位置的深度，保证移植物的贴服。移植物由供体原位部分取下后，按制备的缺损深度，分别在移植物的12、3、6、9点做标记，并用摆锯沿标记截取。使用大量盐水进行冲洗将髓内组织冲洗干净，减少抗原性。将移植物原方位放置于宿主骨缺损处，轻轻垂直方向敲击到位，避免大力敲击造成移植物的碎裂或软骨损伤。软骨边界不服帖处调整移植物方向，冲洗缝合切口［20-21］。

在多个软骨缺损及区域有重叠时，例如股骨滑车病灶，损伤软骨形状长度大于宽度时，移植物重叠区有压配不确切而致软骨脱落的风险。术中只有确认患者软骨缺损位置制备完毕后才能决定截取供体软骨的区域，使关节面平滑匹配。若移植物与缺损区域不匹配时，可将不匹配的象限转向关节非负重面。

由于关节外形进行重塑时，移植物往往处于关节面的最受力的区域，因此与术前的关节面相比，移植物所受应力较术前要高。术中截取移植物体积略大于缺损区域，以有利于移植物的固定。当出现以下情况时需要进行固定：① 移植物尺寸较小，无法稳定于缺损处。② 多个移植物同时固定时，出现移植物或接口处的不稳定。③ Shell技术固定原理与Plug不同，需要借助内固定进行固定。

OCA术后移植物在愈合过程中的超负载是OCA失败的重要原因之一。同样，进行OCA手术的部分患者中，由其是膝关节损伤的患者，下肢力线异常导致关节软骨异常磨损。因此OCA手术同时或之前进行截骨术、纠正力线，有利于OCA术后移植物的愈合及关节功能的恢复。Drexler等［22］报告了OCA术后中长期随访，对于下肢力线异常的患者，OCA合并截骨术，术后10年移植物存活率近90%。

股骨滑车是OCA手术最常修复的部位，但往往同时进行单间室两处以上损伤或同时进行多间室损伤修复时，手术失败率要高于单间室的单处损伤。有多种因素造成这样的结果，例如免疫原性增强、移植物的吸收引起失稳或应力过载因素。尽管如此，但软骨多极损伤进行OCA术后，患者关节功能仍可能明显改善，疼痛消失，患者满意度高。胫骨平台的软骨损伤常合并半月板损伤，因其表面解剖结构与股骨髁不同，需要使用Shell技术，文献报道OCA治疗创伤性胫骨平台软骨损伤合并截骨术，术后10年，移植物存活率近90%，术后20年存活率约50%，术后关节功能良好［22］。而Getgood等［23］报道OCA连带同种异体半月板植移，48例患者平均随访时间为6.8（1.7～17.1）年，失败患者平均翻修时间为3.2年，术后10年存活率为68%。

OCA技术同样可以修复髌股关节面软骨损伤，髌股关节面通常累及髌骨关节面及股骨滑车的关节面，手术要同时处理两处损伤，其术后存活率低于股骨滑车OCA术后，可能的原因是：① 复杂的修复技术，髌骨关节面使用Shell技术修复，股骨滑车使用Plug技术修复。② 复杂的关节面应力，髌股关节几何形状决定其术后关节应力较股骨髁关节面要复杂。手术的同时要纠正髌骨力线及滑动轨迹。

相对于膝关节，OCA修复踝关节巨大软骨损伤存活率要低。Haene等［24］使用OCA技术对16例患者（17踝）进行巨大软骨损伤进行修复，术后平均随访4.1年，2例出现骨质不愈合，5例需要再次手术，CT检查可见骨溶解、软骨下骨囊性变、软骨退变等。总体评价16例患者中，10例踝关节症状改善，6例患者有持续疼痛症状，只有4例患者术后无症状。而Gross等［25］报道OCA技术治疗9例踝关节软骨损伤患者，其中6例患者术后11年，移植物状态良好。之所以有如此差异，一方面由于患者适应证不同，显然，软骨损伤越重，关节软骨缺损越大，移植物存活率越低；另一方面可能与手术技术水平相关。

6 术后管理

膝关节OCA术后早期需要控制疼痛、关节肿胀以及关节活动范围。关节限制负重至少6周，通常接近8～12周，使用可锁定的支具固定膝关节，维持关节稳定。对于髌股关节行OCA手术的患者术后4周，膝关节屈曲不超过45°，胫骨或双极损伤移植的患者要选用适合的支具来支撑膝关节，同时控制内/外翻的应力。胫骨平台联合半月板移植的患者，术后6周膝关节屈曲控制在90°以内。术后2～4个月拐杖辅助下逐步负重活动，通常在术后3～4个月可以正常负重行走。一般术后6个月影像学证实骨质愈合后，可正常参加文体活动。如果术中移植术稳定好，术后功能康复计划相对简单。术后早期的康复内容主要是关节活动度及肌力恢复，如肌四头等长收缩、非负重下关节屈伸活动。在完全康复前，避免随意无计划的锻炼。

髋关节OCA术后即可进行非负重的关节活动度功能锻炼，术后6～8周开始限制性负重或进行如自行车器械的康复训练。术后2周、6周、3个月、6个月及每年进行双髋正位片、下肢全长像、双髋蛙式位片及双髋MRI（术后6个月）影像学检查，确定移植物与宿主融合后可进行正常负重及活动。这通常需要6～12个月的时间［26］。

踝关节OCA术后需要使用类似弹力绷带、防血栓袜等加压装置来控制肿胀。对于较大面积软骨修复或多处软骨修复，术后需要石膏托固定并完全限制负重3个月。每天3～4次轻柔地进行踝关节屈伸活动，但避免极度屈伸，这样可能造成移植物表面应力集中。术后6周时可增加踝关节活动范围，由其是屈曲及背伸。术后3个月使用拐杖在支具保护下开始限制性负重，术后4个月去除支具固定，如果影像学证实移植物及宿主界面骨愈合则逐步过渡为正常负重。

通常在OCA术后1年患者关节功能改善明显，有部分患者术后1～2年关节功能仍表现为持续的改善过程，合理的康复计划能有利于关节功能的恢复。术后4～6周、3个月、6个月及每年进行随访及影像学检查，对移植物及宿主界面骨愈合情况进行评估，若出现延迟愈合则要限制负重或高活动度的运动。

7 并发症及术后转归

OCA术后特有的早期并发症较少，与其他开放性关节手术相比，感染风险一致。使用小切口手术能降低术后关节僵硬的风险。部分患者会出现关节肿胀，可能与免疫介导的滑膜炎相关。术后影像学检查可以发现移植物与宿主界面的愈合情况。体积较大的移植物如胫骨平台或骨坏死修复的骨块不愈合或延迟愈合几率相对较高，因此这类患者术后恢复时间相对长，术前需要向患者告知。术后6个月内连续随访行X线检查较MRI有意义。

移植物的自然退变在影像学表现为移植物局部出现硬化、关节间隙变窄、骨赘形成、软骨下骨囊性变、塌陷或碎裂。症状上则表现为轻微外伤后出现关节疼痛加重、关节积液。病理表现为移植物与宿主骨不融合［27］。

OCA手术是否成功或者移植物是否能长期稳定地固定于宿主体内，与其软骨下骨的转归有关。研究证实，因其他原因进行关节置换术的OCA术后患者，将其移植物取出并进行病理检查，移植物软骨下骨的骨小梁内骨陷窝空虚，其内无成骨细胞，而宿主骨小梁不断吸收并爬行替代长入移植物软骨下骨骨小梁内并与之融合、取代。OCA长期并发症主要原因是由于移植物与宿主骨整合失败和宿主关节疾病加重引起，很少是因为软骨部分引起［28］。

尽管OCA手术移植物随时间延长，移植物生存率不断降低。当各种原因引起OCA术后失败时，患者将面临两种选择，进行OCA翻修手术（再次移植一个新的同种异体骨软骨）或进行关节置换手术。应根据患者及关节功能情况进行选择，以下情况可以考虑OCA翻修术：① 原软骨损伤邻近区域软骨功能良好，仅OCA术区软骨退变；② 急性关节创伤引起的OCA手术失败；③ 患者不愿接受关节置换术；④ 年轻患者，关节功能要求高，活动量大；身高体重指数＜35。目前对于OCA术后失败是否行OCA翻修术无明确的专家共识来指导临床。Horton等［29］对33例OCA术后失败的病例进行OCA翻修，75%患者随访时间为10年，OCA翻修术后移植物10年存活率为61%。但相对于OCA初次手术，OCA翻修术失败率高，术后患者关节疼痛，功能、满意度较初次OCA手术无明显差异。同样也有学者认为，在周围软骨良好的情况下，OCA翻修术成功率与初次OCA手术相当。

年轻患者软骨损伤无论是对于患者还是对于医生而言都是一个难题。OCA技术在治疗关节软骨损伤中有着独特的作用，尤其是膝关节软骨损伤方面良好且可靠［30］。它很好地衔接在微骨折术、自体软骨细胞移植术、自体骨软骨移植术与关节置换术之间，为患者关节软骨疾病早期提供了有效的治疗手段。