异甘草素对小儿血管瘤内皮细胞生物学特性及PI3K/AKT信号通路的影响

李 燕，张瑞丽

1)郑州大学附属儿童医院(河南省儿童医院；郑州儿童医院)药学部 郑州 450000 2)中国中医科学院望京医院药学部 北京 100102

血管瘤是一种常发生于婴幼儿皮肤和软组织的先天性良性肿瘤或血管畸形，大部分可自行消退，但也有一少部分因生长在特殊部位或体积过大等因素影响到组织或器官功能，甚至危及生命。血管瘤常见的治疗方法如手术切除、药物治疗和硬化治疗等均不能达到理想的治疗效果，因此寻找安全有效的治疗手段一直是血管瘤临床研究的热点。血管瘤以血管内皮细胞增生为主，抑制血管内皮细胞的过度增殖对血管瘤的治疗具有重要意义。异甘草素是一种从中草药甘草中提取的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等药理活性，其抗肿瘤活性已引起人们的重视[1-2]。PI3K/AKT信号通路是血管形成的重要调节途径，在血管瘤中异常活化[3]。近年来有研究[4-6]报道，异甘草素具有抗血管生成的作用，并能够抑制实体瘤中PI3K/AKT信号通路激活，但其对小儿血管瘤内皮细胞生物学行为和PI3K/AKT信号通路的影响尚不清楚。本研究旨在探讨异甘草素对小儿血管瘤内皮细胞生长、侵袭和凋亡的影响及其机制，以期为儿童血管瘤的临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1材料小儿血管瘤内皮细胞购自大连美仑生物公司。异甘草素购于美国Sigma公司，纯度≥98%，使用时以DMSO溶解。RPMI 1640细胞培养基购于美国Gibco公司，胎牛血清购于杭州四季青生物公司，MTT试剂购于美国Promega公司，DMSO购于美国Sigma公司，RIPA裂解液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、反转录试剂盒和细胞周期检测试剂盒均购于中国碧云天生物技术研究所，Annexin V-FITC/PI试剂盒购于凯基生物公司，CyclinB1、Bax、MMP-9和p-Akt抗体均购于美国Abcam公司，Cleaved Caspase-3抗体购于武汉博士德公司，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司。流式细胞仪购于美国BD Pharmingen公司，倒置显微镜购于日本Olympus公司，Transwell小室购于美国Coming公司，全自动酶标仪和细胞培养箱购于美国Thermo公司，转膜仪购于美国Bio-RAD公司。

1.2细胞培养小儿血管瘤内皮细胞复苏后，用含100 U/mL青链霉素双抗和体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，置于体积分数5%CO2、37 ℃的细胞培养箱内常规培养。细胞贴壁后，每2 d换液一次，待细胞铺满瓶底75%左右时，以胰蛋白酶消化传代。

1.3细胞活力检测取96孔细胞板，以每孔100 μL接种处于对数生长期的小儿血管瘤内皮细胞，细胞密度为2×105个/mL，设对照组和低、中、高浓度异甘草素组，分别用0、20、40和80 μmol/L异甘草素处理，每组6个平行孔，另设1个只含有培养基的空白调零孔。于培养箱内分别培养24、48和72 h后，加入5 g/L MTT溶液200 μL。再培养4 h后，加入120 μL DMSO反应10 min。上酶标仪检测各组细胞在490 nm处的吸光度(A)值，细胞存活率=(实验组A-空白A)/(对照组A-空白A)×100%。实验重复3次，下同。

1.4细胞侵袭能力的检测收集上述培养72 h的各组细胞，经2.5 g/L胰蛋白酶消化后，更换为无血清的RPMI 1640培养基，采用细胞计数设备计数。取Matrigel基质胶包被的Transwell小室，在下室中加入500 μL完全培养基，上室中加入400 μL含105个细胞的细胞悬液，置于培养箱中培养24 h后取出。用磷酸盐缓冲液洗涤上层小室，晾干后于预冷的甲醇中固定30 min。去甲醇并洗涤后，加入结晶紫染色20 min。洗涤晾干后，于倒置显微镜下观察。选取6个区域计数细胞，细胞侵袭能力以6个区域细胞数的平均数来表示。

1.5细胞周期和凋亡检测取生长良好的小儿血管瘤内皮细胞，以每孔2×105个/mL的密度接种至6孔细胞板，每孔100 μL。按照1.3中的分组处理细胞72 h，以胰蛋白酶消化后，加入500 μL 完全培养基终止消化，转移至离心管中，1 000 r/min离心5 min。经磷酸盐缓冲液洗涤3遍后，分别参照试剂盒说明书的步骤检测细胞周期和凋亡。

1.6PI3K/AKT信号通路相关分子mRNA的检测采用实时荧光定量PCR法。收集培养72 h后的各组细胞，采用Trizol法提取总RNA。用反转录试剂盒以总RNA为模板合成cDNA。配制含有2 μL cDNA、8.5 μL ddH2O、12.5 μL SYBP Premix Ex Taq和各1 μL上下游引物的反应体系，反应条件：95 ℃预变性60 s；95 ℃变性15 s，52～62 ℃退火20 s，72 ℃延伸70 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA的相对表达量。其中，由上海生工生物工程股份有限公司合成的各引物序列见表1。

1.7PI3K/AKT信号通路相关分子蛋白的检测采用Western blot检测。收集培养72 h后的各组细胞，加入RIPA裂解液提取总蛋白，并根据BCA蛋白检测试剂盒测定提取总蛋白的浓度。取60 μg总蛋白与蛋白上样缓冲液(体积比5∶1)混匀后置于95 ℃下反应10 min。采用移液枪将蛋白上样至 SDS-PAGE凝胶中以80 V电压电泳2 h。转膜后，放入含去脂奶粉的封闭液中反应1.5 h。以封闭液洗涤后，加入Cleaved Caspase-3(1∶800稀释)、Bax(1∶500稀释)、CyclinB1(1∶500稀释)、MMP-9(1∶1 000稀释)和p-AKT(1∶5 000稀释)抗体，4 ℃摇床孵育24 h。以封闭液洗涤后，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37 ℃反应1.5 h。洗膜后，加入ECL显影，凝胶成像系统收集图片，以β-actin为内参，校正目的蛋白的相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

F:上游引物；R：下游引物

1.8统计学处理应用SPSS 22.0处理数据。采用3×4析因设计的方差分析比较不同浓度的异甘草素处理不同时间对细胞存活率的影响，多组间其他指标的比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组细胞存活率的比较随异甘草素作用浓度的增加和作用时间的延长，小儿血管瘤内皮细胞存活率降低，见表2。

2.2 4组细胞侵袭能力的比较处理72 h后，对照组侵袭细胞数为(165.25±8.52)，低、中、高浓度异甘草素组侵袭细胞数减少，分别为(137.82±6.35)、(87.65±5.80)和(54.37±5.05)(F=18.847，P=0.002)。

表2 4组细胞存活率的比较(n=3) %

F组间=226.648，P<0.001；F时间=30.221，P<0.001；F交互=5.105，P=0.002

2.3 4组细胞周期分布和细胞凋亡情况比较处理72 h后，随异甘草素作用浓度的升高，G0/G1期细胞百分比逐渐降低，而G2/M期细胞百分比逐渐升高。同时，异甘草素能够呈浓度依赖性诱导细胞凋亡。见表3。

表3 4组细胞周期分布和凋亡率的比较(n=3) %

*：组间两两比较，P<0.05

2.4 4组细胞PI3K/AKT信号通路相关分子mRNA及蛋白表达的比较见图1。随异甘草素作用浓度的增加，Cleaved Caspase-3、Bax mRNA表达水平逐渐升高，而CyclinB1、MMP-9、p-AKT mRNA表达水平逐渐下降，见表4。PI3K/AKT信号通路相关分子蛋白的表达结果与mRNA一致，见表5。

1～4：分别为对照组和低、中、高浓度异甘草素组

组别Cleaved Caspase-3*Bax*CyclinB1MMP-9*p-AKT*对照组1.00±0.071.16±0.123.78±0.623.62±0.562.66±0.39低浓度异甘草素组1.38±0.121.85±0.362.85±0.452.75±0.382.08±0.35中浓度异甘草素组1.79±0.162.67±0.281.89±0.30#1.89±0.451.32±0.21高浓度异甘草素组2.25±0.283.58±0.551.02±0.12#△1.00±0.200.83±0.06F28.123 24.969 24.710 21.711 30.244 P<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

*：组间两两比较，P<0.05；#:与对照组和低浓度异甘草素组比较，P<0.05；△：与中浓度异甘草素组比较，P<0.05

表5 4组细胞中PI3K/AKT信号通路相关分子蛋白的相对表达量(n=3)

*：组间两两比较，P<0.05；#:与对照组和低浓度异甘草素组比较，P<0.05；△：与中浓度异甘草素组比较，P<0.05

3 讨论

血管瘤的治疗一直是临床上的棘手问题，手术切除治疗虽然效果较好，但在一些特殊器官如眼、鼻和耳等不宜开展，因此寻找安全有效的治疗药物一直是血管瘤研究的热点。甘草是一种补益中草药，具有祛痰止咳、补中益气、缓急止痛、解毒和调和诸药等功效。异甘草素是从甘草根分离出来的黄酮类化合物，其抗肿瘤活性在肿瘤治疗领域备受关注。Peng等[7]发现，异甘草素通过降低miR-37a增加PTEN的表达，抑制AKT信号，发挥抗乳腺癌细胞增殖和迁移的作用。Chen等[8]在卵巢癌中也证实异甘草素能够呈浓度、时间依赖性抑制肿瘤细胞的活力，诱导G2/M期阻滞和细胞凋亡。此外，异甘草素也表现出较好的抗血管生成的作用。Ji等[5]研究指出，异甘草素通过抑制软骨下骨的骨吸收和血管生成延缓骨关节炎的进展；王志强等[9]发现，异甘草素可抑制人微血管内皮细胞增殖、迁移，诱导细胞阻滞于S期并促进细胞凋亡。然而，异甘草素对血管瘤内皮细胞的影响未见报道。本研究以20、40和80 μmol/L的异甘草素处理体外培养的小儿血管瘤内皮细胞，采用常规生物学手段检测细胞生长、侵袭、凋亡以及细胞周期变化。结果发现，异甘草素能够呈时间、浓度依赖性抑制小儿血管瘤内皮细胞的生长，并呈浓度依赖性抑制其侵袭，诱导细胞凋亡，使细胞阻滞于G2/M期。这一结果进一步验证了异甘草素抗肿瘤的广谱性。

肿瘤细胞的生长和转移有赖于肿瘤血管的生成，而肿瘤血管生成的过程是一个受多种基因和信号通路共同调控的复杂过程，PI3K/AKT通路是该过程中一条重要的信号通路。AKT是PI3K/AKT信号通路的核心蛋白，活化的AKT可通过直接或间接介导下游相关蛋白参与肿瘤细胞的生物学过程，调控肿瘤血管生成[10-12]；CyclinB1是一种G2期周期蛋白，在细胞从G2进入M期过程中发挥促进作用。Bax是Bcl-2基因家族中的促凋亡基因，可与抑凋亡基因Bcl-2形成异二聚体，抑制Bcl-2 产生，促进细胞凋亡；Caspase-3是公认的细胞凋亡执行因子，Caspase-9的活化可激活下游Caspase-3引起细胞凋亡；MMP-9是MMPs家族成员，在维持细胞外基质降解和重塑过程中发挥着重要作用，与肿瘤细胞的转移关系密切；同时，CyclinB1、Bax、Caspase-9和MMP-9均是AKT下游相关靶基因，也均在血管瘤的发生发展中发挥着重要作用[13-15]。此外，吉毅等[16]指出PI3K/AKT信号通路在婴幼儿血管瘤中异常活化，抑制PI3K/AKT通路能够明显促进血管内皮细胞的凋亡。Huang等[6]研究已证实异甘草素可通过阻断PI3K/AKT信号通路抑制结肠癌细胞增殖和凋亡。本研究结果显示，异甘草素处理后小儿血管瘤内皮细胞中Cleaved Caspase-3和Bax表达均升高，而CyclinB1、MMP-9和p-AKT表达均降低。这一结果与前人[3,17-18]发现的异甘草素可通过下调CyclinB1表达诱导宫颈癌细胞周期阻滞在S和G2/M期，下调MMP-9蛋白的表达可抑制胃癌细胞的侵袭，上调Caspase-3和Bax表达可诱导膀胱癌细胞凋亡的结果相吻合。提示异甘草素可能通过抑制PI3K/AKT信号通路的活化发挥抑制血管瘤内皮细胞生长、侵袭和促进凋亡的作用。

综上所述，异甘草素可抑制小儿血管瘤内皮细胞生长和侵袭，并促进细胞凋亡，其机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路活化有关。这一研究结果为异甘草素用于临床治疗小儿血管瘤提供了理论依据。