TLR4对肺炎链球菌诱导的A549细胞凋亡的影响

李莲梅，余博文，毕建朋，王曼华

1)青海省妇女儿童医院感染消化科 西宁 810000 2)西宁市城西区疾病控制中心疾控科 西宁 810000 3)郑州大学附属儿童医院 (河南省儿童医院；郑州儿童医院)泌尿外科 郑州 450052 4)河南广播电视大学农医学院 郑州 450046

肺炎是5岁以下儿童死亡的重要原因之一[1]。肺炎链球菌是儿童社区获得性肺炎的主要病原。肺泡上皮细胞可以合成和分泌多种活性物质，参与肺炎发生过程。肺泡上皮细胞可以分为Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅱ型肺泡上皮细胞具有维持肺组织正常功能、分泌肺泡表面活性物质等作用，与肺炎发生密切相关[2-3]。Toll样受体4(toll-like receptor-4，TLR4)参与介导细胞凋亡、炎症、氧化应激等多种病理生理过程，在肺炎引起的肺损伤中发现肺组织中TLR4高表达，TLR4在内毒素、脂多糖等诱导的肺泡上皮细胞损伤中表达上调[3-5]。本实验以Ⅱ型肺泡上皮细胞来源的A549细胞作为研究对象，探讨TLR4在肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡中的作用，以期为明确肺炎肺泡上皮细胞损伤机制提供参考。

1 材料与方法

1.1材料肺炎链球菌R6购自美国ATCC公司，细胞色素C(Cytochrome C)抗体购自碧云天生物技术研究所，胞浆蛋白提取试剂盒、线粒体蛋白提取试剂盒购自美国Thermo公司，qRT-PCR试剂盒购自美国Clontech公司，TLR4 siRNA慢病毒和siRNA阴性对照慢病毒、TLR4抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2细胞分组和培养A549细胞分成4组：对照组(不用肺炎链球菌诱导刺激)、肺炎链球菌组(培养细胞密度为70%时，在细胞中添加1×107CFU/L的肺炎链球菌进行诱导刺激)、siRNA-NC组(肺炎链球菌诱导刺激A549细胞后，感染siRNA阴性对照慢病毒)和siRNA-TLR4组(肺炎链球菌诱导刺激A549细胞后，感染TLR4 siRNA慢病毒)，每组均设5个平行对照。4组细胞继续培养24 h以后，用qRT-PCR和Western blot检测沉默效果。

1.3 4组细胞中TLR4mRNA表达水平的qRT-PCR检测用总RNA提取试剂盒分别提取4组细胞中的总RNA，用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，以cDNA作为模板进行PCR扩增。qRT-PCR采用20 μL的反应体系，荧光预变性反应条件为95 ℃ 30 s；PCR反应条件：95 ℃ 5 s、55 ℃ 30 s，45个循环。按照2-ΔΔCt法分析各组细胞中TLR4 mRNA水平。TLR4上游引物序列5’-AGAGCTGAAATG GAGGCACC-3’，下游引物序列5’-AGGACCAGAG GCAGCTCTTG-3’；β-actin上游引物序列5’-TCATT GACCTCAACTACATGGTTT-3’，下游引物序列5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.4 4组细胞中TLR4、CleavedCaspase-3、细胞胞浆和线粒体中CytochromeC蛋白表达水平的Westernblot检测4组细胞用冰预冷的PBS洗涤2次后，分别添加细胞裂解液，放在冰上裂解约30 min，收集裂解细胞，转移到EP管，4 ℃离心后，把上层溶液(蛋白上清液)转移到EP管中，保存在-70 ℃冰箱。蛋白浓度检测按照BCA蛋白定量检测试剂盒。蛋白样品变性(与Loading Buffer混合煮沸5 min)处理以后，分别添加到凝胶样品孔内，设置浓缩胶中电压为60 V，分离胶中电压为120 V。把凝胶取出，置于转移缓冲液中孵育15 min，再把PVDF膜置于甲醇溶液中充分浸泡10 min。转膜置于4 ℃中进行，设置120 mA电流转膜60 min，用50 g/L牛血清白蛋白常规封闭以后，与TLR4(按1∶200稀释)、Cleaved Caspase-3(按1∶100稀释)和Cytochrome C(按1∶200稀释)一抗置于4 ℃中反应过夜后，再与辣根过氧化物酶标记的IgG二抗(按1∶4 000稀释)在室温条件下孵育结合90 min，ECL法化学发光，Odyssey FC显影，利用LabWorks 4.5对各蛋白进行定量(内参为β-actin)。

1.5 4组细胞凋亡的流式细胞术检测4组细胞按照1.2方法处理培养24 h以后，加入冰预冷的PBS重悬，离心后，用结合缓冲液悬浮细胞，添加Annexin V-FITC和PI混合后，置于室温中孵育15 min。立即用流式细胞仪测定各组细胞凋亡率。

1.6统计学处理采用SPSS 21.0进行分析，应用单因素方差分析和SNK-q检验比较4组细胞中TLR4表达水平、细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3蛋白、胞浆和线粒体中Cytochrome C表达的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组细胞中TLR4mRNA和蛋白表达变化见图1和表1。由图1和表1可知，TLR4 siRNA慢病毒感染可有效降低肺炎链球菌诱导处理的A549细胞中TLR4 mRNA和蛋白的表达水平。

1：对照组；2：肺炎链球菌组；3：siRNA-NC组；4：siRNA-TLR4组

组别TLR4 mRNATLR4蛋白对照组1.00±0.090.21±0.02肺炎链球菌组1.89±0.13#0.59±0.06#siRNA-NC组1.87±0.120.57±0.05siRNA-TLR4组0.85±0.07*0.26±0.03*F83.380 65.120 P<0.001 <0.001

#：与对照组比较，P<0.05；*:与siRNA-NC组、肺炎链球菌组比较，P<0.05

2.2 4组细胞凋亡和CleavedCaspase-3蛋白表达水平的比较结果见图2和表2。由表2可知，A549细胞经肺炎链球菌诱导处理后，细胞凋亡率和细胞中Cleaved Caspase-3蛋白表达水平均升高，而沉默TLR4表达的A549细胞凋亡率和细胞中Cleaved Caspase-3蛋白表达水平均降低。

1：对照组；2：肺炎链球菌组；3：siRNA-NC组；4：siRNA-TLR4组

组别凋亡率/%Cleaved Caspase-3对照组5.69±0.780.20±0.03肺炎链球菌组38.26±3.47#0.62±0.05#siRNA-NC组39.52±2.140.60±0.07siRNA-TLR4组24.17±3.82*0.42±0.05*F47.340 42.370 P<0.001 <0.001

#：与对照组比较，P<0.05；*:与siRNA-NC组、肺炎链球菌组比较，P<0.05

2.3 4组细胞胞浆和线粒体中CytochromeC蛋白表达水平的比较结果见图3和表3。由表3可知，A549细胞经肺炎链球菌诱导处理后，细胞胞浆中Cytochrome C蛋白表达水平升高，线粒体中Cytochrome C蛋白表达水平降低。沉默TLR4表达的A549细胞胞浆中Cytochrome C蛋白表达水平降低，线粒体中Cytochrome C蛋白表达水平升高。

上：胞浆中Cytochrome C蛋白的表达；下：线粒体中Cytochrome C蛋白的表达；1：对照组；2：肺炎链球菌组；3：siRNA-NC组；4：siRNA-TLR4组

图3 4组细胞胞浆和线粒体中Cytochrome C蛋白的表达

#：与对照组比较，P<0.05；*:与siRNA-NC组、肺炎链球菌组比较，P<0.05

3 讨论

肺泡上皮细胞存在于肺泡表面，可分为Ⅰ型肺泡上皮细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞，二者存在于同一个基底膜，共同构成肺上皮屏障，能够维持肺泡相对干燥、清除肺泡过多液体。Ⅱ型肺泡上皮细胞占肺泡细胞的16%，仅覆盖了肺泡总面积的5%左右，其具有跨膜运输、分泌活性物质的作用，参与氧化代谢等过程；其既可以增殖产生新的Ⅱ型肺泡上皮细胞，又可以分化成Ⅰ型肺泡上皮细胞。有研究[6-7]表明，肺炎发生与Ⅱ型肺泡上皮细胞过度凋亡有关。肺炎链球菌是小儿肺炎发生的重要病原体，其可以诱导肺泡上皮细胞损伤，进而影响肺组织正常功能的发挥[8-9]。本实验结果表明，肺炎链球菌诱导处理后的肺泡上皮细胞A549凋亡增多，提示肺炎链球菌可以诱导肺泡上皮细胞凋亡，这与上述报道一致。

TLR4是与天然免疫密切相关的受体，其属于Toll受体家族。TLR4分子含有胞内区、胞外区和穿膜区，其胞外区含有丰富的亮氨酸，能够与CD14分子序列结合而影响蛋白质之间的相互作用；胞内区为一段保守的序列，其与白细胞介素1受体的胞内区同源性极高，因此，TLR4又属于白细胞介素1受体超家族成员[8-10]。有研究[11-14]显示，TLR4在巨噬细胞、淋巴细胞、内皮细胞等各种类型的细胞中存在，在肺脏、胎盘、脾脏等组织中广泛表达；TLR4参与细胞正常生理功能发挥，并且与肿瘤、肺炎、糖尿病等多种疾病的发生有关。多个研究[5-6,15]表明，TLR4在肺炎大鼠肺组织中高表达；在脂多糖诱导的肺泡上皮细胞损伤中同样发现TLR4高表达。本实验表明，肺炎链球菌诱导处理后的肺泡上皮细胞中TLR4表达水平升高，沉默TLR4可以明显抑制肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡，提示沉默TLR4在肺炎肺泡上皮细胞损伤中可能发挥保护作用。

线粒体凋亡途径是目前发现的与细胞凋亡有关的经典凋亡途径，其在心肌细胞、肌细胞、皮肤细胞、巨噬细胞等多种细胞中均广泛存在，线粒体凋亡途径的关键是线粒体中Cytochrome C的释放，线粒体受到外界因素刺激以后，线粒体膜电位下降，使存在于线粒体中的Cytochrome C进入到胞浆中，而Cytochrome C可以同胞浆中Caspase反应，诱导Caspase级联反应的发生，最终诱导细胞凋亡发生[16-17]。Caspase-3活化是细胞凋亡发生的标志，也是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志[18]。本实验结果显示，沉默TLR4后肺泡上皮细胞线粒体中Cytochrome C蛋白水平升高，胞浆中Cytochrome C蛋白水平降低，细胞中Cleaved Caspase-3水平降低，提示沉默TLR4可能通过线粒体途径抑制肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡。

综上所述，TLR4参与肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡过程，沉默TLR4的表达可减少肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡。本实验没有在原代肺泡上皮细胞和体内进行验证，后续实验将进行探讨。